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口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma)是常见的头颈部恶性肿瘤,位居全球十大高发癌症之一,发病率逐年增高,其中舌鳞状细胞癌(squamous cells carcinoma of the oral tongue, SCCOT)最为常见,占口腔黏膜鳞癌第一位。SCCOT具有恶性程度高、转移率高等特点。微管驱动蛋白在细胞内转运、分裂和双极纺锤体形成中作用显著,最近的研究则显示其与肿瘤发生、发展密切相关。驱动蛋白Kinesin-13家族包括Kif2a、Kif2b及Kif2c,可通过解聚微管蛋白参与纺锤体的组装并调节细胞骨架的动态变化进而促进细胞的增殖,介导细胞的运动及迁移。文献报道Kif2a在多种类型肿瘤的发生、侵袭和转移中发挥重要作用。我们课题组之前的研究也发现Kif2a在舌鳞状细胞癌中的表达异常,Kif2a的表达水平与肿瘤的临床分期、淋巴结转移有关。肿瘤的发生是个复杂的过程,除了与肿瘤细胞的异常分化和过度增殖有关以外,与细胞凋亡的减少存在密切联系。研究表明,细胞骨架参与调解细胞凋亡,然而Kif2a是否参与调节舌鳞状细胞癌凋亡及其分子机制仍不清楚。本研究中,我们在以往研究的基础上成功构建Kif2a siRNA表达载体,通过转染舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113,利用基因芯片方法筛选受Kif2a调节的差异基因表达,并通过生物信息学手段分析差异基因参与调节的信号通路,为进一步揭示Kif2a在肿瘤中的作用及机制提供数据支持及新思路。此外,我们探讨Kif2a沉默对舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113凋亡的影响及机制,进一步补充了Kif2a在肿瘤发生中的作用及机制,提示Kif2a可能成为舌鳞状细胞癌的新的治疗靶点,为舌癌治疗提供新的有效的治疗策略。第一部分基因沉默Tca8113Kif2a表达的全基因组表达谱分析目的：构建Kif2a siRNA表达载体,利用基因芯片技术比较分析Kif2a基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113全基因组表达谱的影响,利用生物信息学工具筛选与Kif2a信号通路相关的基因及通路,为进一步探讨Kif2a在舌鳞状细胞癌中的作用机制提供依据。方法：1. Kif2a siRNA干扰载体构建根据Kif2a序列,设计Kif2a干扰序列,同时设计无意对照序列(具体序列见表1),然后合成shRNA并克隆入pGPU/GFP/Neo表达载体,构建Kif2a干扰载体及无意对照载体,分别命名为pGPU6/GFP/Neo-Kif2a及pGPu6/GFP/Neo-NC。重组质粒进一步测定序列验证构建成功。2.干扰载体转染Tca8113细胞系将对数生长期的Tca8113细胞系以2x105数目接种于6孔培养板中。当细胞融合率达到40%左右,通过脂质体法分别转染pGPU6/GFP/Neo-Kif2a、 pGPU6/GFP/Neo-NC及空脂质体对照。于转染24h收集细胞,Trizol法提取细胞总RNA,应用qRT-PCR检测Kif2a mRNA水平；于转染72h收集细胞,提取细胞总蛋白,Western-Blot检测Kif2a的蛋白水平表达。通过与对照组比较Kif2a基因、蛋白的表达,评价pGPU6/GFP/Neo-Kif2a干扰载体的干扰效率。3.RNA提取及质控收集对数生长期各组细胞5×105个,加Tirzol裂解,提取总RNA。NanoDrop1000测量所提取RNA的浓度和纯度,2100bioanalyzer lab-on-chip进一步对RNA样本进行质量控制,选择质量合格的RNA样品进行基因芯片杂交分析(上海康成生物有限公司)。4.基因芯片将质量检测合格的RNA标本,使用安捷伦快速扩增标记试剂盒将RNA转录并标记荧光,Nanodrop检测荧光标记效率,将标记的样品与全基因组芯片(4×44K)进行杂交,洗净杂交芯片以去除未结合标本,然后使用Agilent ScannerG2505B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,采用LuxSCan3.0图像分析软件(CaPital Bio公司)对芯片图像进行分析,然后对芯片上的数据进行归一化处理,荧光染料Cy3的信号用绿色表示,Cy5的信号用红色表示。整合两张芯片荧光强度的比值,即Ratio值,以整合后的Ratio值≥2.0或≤0.5为标准确定差异表达基因,其中Ratio值≥2表示基因表达上调,Ratio值≤0.5表示基因表达下调。5.生物信息学分析对差异基因进行系统聚类分析,分析各组间基因表达谱。根据KEGG数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes),利用Biorag分析差异基因参与的信号通路(Pathway Analysis),进一步阐明差异基因介导的生物学功能。结果：1. pGPU6/GFP/Neo-Kif2a有效下调Kif2a的]mRNA及蛋白水平表达将成功构建的Kif2a siRNA干扰载体转染Tca8113细胞系,通过荧光显微镜观察GFP显示载体成功转染Tca8113,通过流式细胞分析转染效率达到90%以上；RT-PCR结果显示,干扰组显著抑制Tca8113细胞Kif2a mRNA的表达；Western Blot结果则显示干扰组Tca8113细胞Kif2a蛋白表达亦显著下调(下调80.67%)。2.基因芯片RNA标本质控基因芯片所需RNA标本经NanoDrop1000分析,OD260/OD280均在1.8-2.0之间,2100bioanalyzer lab-on-chip结果显示清晰18s28s rRNA峰值,RNA标本完整性较好。3.基因芯片分析基因芯片扫描结果显示信号清晰,背景均匀,重复实验效果良好。芯片结果显示,与NC对照相比,沉默Kif2a显著上调744个基因的表达,同时显著下调1282个基因表达。4.差异基因参与调节信号通路的分析差异表达基因的通路分析结果显示差异表达的基因涉及多个通路,主要包括核糖体通路、类固醇生物合成、DNA复制、碱基切除修复、精氨酸／脯氨酸代谢、错配修复、蛋白酶体、细胞周期／有丝分裂、细胞凋亡以及PI3K/Akt信号转导通路。其中,与内质网蛋白质加工相关蛋白的表达上调显著,包括BAX,SEC63,RAD23B, EIF2AK2, FBXO2, WFS1, BCAP31, MBTPS1, YOD1, LMAN1。结论：所构建Kif2a siRNA干扰载体可有效沉默Kif2a在Tca8113细胞中的表达,基因芯片结果显示,Kif2a与细胞有丝分裂、细胞凋亡、细胞迁移等多种信号通路密切相关,Kif2a参与调节PI3K/Akt信号转导通路,为进一步揭示Kif2a在肿瘤中的作用及机制提供数据支持及新思路。第二部分Kif2a通过PI3K/Akt通路调节舌鳞状细胞癌凋亡目的：探讨Kif2a对Tca8113凋亡的影响,并根据基因芯片数据探讨PI3K/Akt信号转导通路是否参与Kif2a对凋亡的调节作用,补充Kif2a在肿瘤发生中的作用机制。方法：1. Kif2a基因沉默将构建好的Kif2a干扰载体脂质体法转染Tca8113细胞系,方法同前。2.细胞凋亡检测Tca8113细胞分别转染pGPU6/GFP/Neo-Kif2a及pGPu6/GFP/Neo-NC对照,在有无胰岛素样生长激素IGF1(PI3K/Akt特异性激动剂)的条件下培养,取各组细胞,AnnexinV/PI染色,BD Calibur流式细胞仪检测凋亡,WinMDI2.8软件分析细胞凋亡率。3.凋亡相关分子检测Tca8113细胞分别转染si-Kif2a及si-NC,未转染组作为空白对照,分别用RT-PCR、Western Blot检测各组细胞PI3K、Akt,、Bcl-2、Bax的水平。4. PI3K/Akt通路检测Tca8113细胞分别转染pGPU6/GFP/Neo-Kif2a及pGPu6/GFP/Neo-NC对照,在有无IGF1的条件下培养不同时间,收集细胞,提取总蛋白,Western Blot检测磷酸化Akt及总Akt水平,探讨Kif2a对PI3K/Akt通路的调节作用。结果：1.沉默Kif2a显著诱导Tca8113-细胞凋亡流式细胞术检测各组细胞凋亡,Tca8113转染空载体细胞组凋亡率为3.73±0.57%,转染NC对照组凋亡率为5.28±0.50%,二者相比,没有显著性差异。相比较而言,沉默Kif2a组凋亡率为28.39±2.89%,与对照组相比凋亡率显著上调(p<0.01)。2.沉默Kif2a显著上调Bax表达,同时抑制Bcl-2的水平Real-time PCR结果显示,与空白及NC对照组相比,沉默Kif2a显著抑制Bcl-2mRNA水平,而沉默Kif2a显著诱导Bax的基因水平表达。与此一致,Western Blot结果显示,沉默Kif2a显著抑制Bcl-2同时上调Bax蛋白水平的表达。提示Kif2a可能通过调节Bcl-2/Bax表达水平调节Tca8113细胞凋亡。3.沉默Kif2a抑制PI3K/Akt表达Real-time PCR及Western Blot结果显示,与空白及NC对照组相比,沉默Kif2a显著抑制PI3K、Akt mRNA和蛋白水平表达,表明沉默Kif2a抑制PI3K/Akt通路。4. Kif2a siRNA通过抑制Akt通路诱导凋亡。PI3K/Akt特异性激动剂IGF1可显著抑制Kif2a沉默所诱导的细胞凋亡,分子机制研究表明,与NC对照组相比,沉默Kif2a组经IGF-1刺激后,Akt磷酸化水平显著降低,进一步表明沉默Kif2a通过抑制PI3K/Akt通路诱导细胞凋亡。结论：我们的结果表明基因沉默Kif2a可通过抑制PI3K/Akt信号通路诱导舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113凋亡,进一步补充了Kif2a在肿瘤发生中的作用及机制,提示Kif2a可能成为舌鳞状细胞癌的新的治疗靶点。