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研究目的类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作,可导致关节内软骨和骨的破坏,关节功能障碍,甚至残废。本病呈全球性分布,患病率约为1%。我国的患病率约为0.32%～0.36%,是造成我国劳动力丧失和致残的主要疾病之一。RA的主要病理改变是滑膜炎,具有类肿瘤样生长的特点,表现为滑膜组织的肥厚增生,血管翳形成,对关节周围的组织产生侵蚀和破坏。RA的发病机制至今仍未完全阐明,人们逐渐认识到血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)可能是RA的发病机制中具有重要作用的细胞因子,并对其展开了深入研究。目前除抗炎及对症治疗外还没有特效的治疗方法。随着人们对血管生成与RA的了解,抗血管生成治疗成为新的研究热点。雷公藤多苷(Tripterygium glucosides)是一种具有多种免疫调节作用的中药制剂,对RA有一定疗效。雷公藤作为目前治疗类风湿关节炎药物中疗效最被肯定的单味中药,主要有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗菌、抗生育等作用,对于前两个作用的研究比较深入,但抗血管生成作用机制以及相关动物实验研究较少。本研究通过观察雷公藤多苷对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的血管内皮生长因子(VEGF)及其受体2(VEGFR2)表达水平的影响,研究雷公藤多苷治疗RA中的抗血管生成作用,并阐明其可能作用机制,为临床合理应用雷公藤多苷治疗RA病人提供实验依据。研究方法1、设计VEGF和VEGFR2的引物和探针,建立检测VEGF和VEGFR2 mRNA的实时荧光定量PCR方法,优化实验条件,并评估其特异性、重复性。2、建立CIA大鼠模型,造模成功后用雷公藤多苷干预,并以沙利度胺作为阳性对照。3、利用建立的实时荧光定量PCR法检测雷公藤多苷对CIA模型大鼠VEGF和VEGFR2基因表达的影响,并用ELISA方法检测大鼠血清中VEGF和VEGFR2含量。4、对VEGF基因在健康大鼠组织(肺、心、肝脏、肾脏、脑、胃、肠和颌下腺)特异性表达进行分析。5、对RA患者滑膜组织进行细胞培养,细胞培养成功后用雷公藤多苷进行干预,观察分析VEGF和VEGFR2的表达情况。结果1、经DNA测序和电泳分析,检测VEGF和VEGFR2的扩增分析是特异的,定量分析其相关系数均>0.98,大鼠VEGF和VEGFR2 mRNA检测的重复性好,其批内变异系数(CV)分别为2.0%～6.7%和2.0%～6.4%,批间变异系数(CV)分别为3.5%～10.6%和3.6%～10.2%。2、模型组大鼠关节评分和肿胀度与正常组相比有明显差异(P<0.01),其滑膜组织病理表现为关节滑膜被覆细胞变性、增生,滑膜间质有炎细胞浸润,并有肉芽组织形成,关节软骨有不同程度的损伤,进而纤维组织增生、关节局部纤维化,严重时导致关节腔消失。关节周围皮下软组织内见“Ⅱ型胶原”引起的迟发性变态反应,局部有多量的类上皮细胞增生呈结节状,并有淋巴细胞浸润。3、雷公藤多苷组、沙利度胺组大鼠各组织中VEGF和VEGFR2 mRNA均低于模型对照组(P<0.05),与沙利度胺组比较无明显差异(P>0.05)。4、健康大鼠肺组织中VEGF mRNA表达最高,与其他任意组相比均具有统计学差异(P<0.05),其它各组织间无统计学差异。5、模型组大鼠血清中VEGF和VEGFR2含量显著高于正常对照组(P<0.05),雷公藤多苷组、沙利度胺组大鼠血清中VEGF和VEGFR2含量低于模型对照组(P<0.05)。6、雷公藤多苷干预RA患者滑膜细胞后,VEGF和VEGFR2 mRNA的水平明显下降((P<0.05)。结论本研究成功建立了准确定量分析VEGF和VEGFR2 mRNA的实时荧光定量PCR方法；通过动物试验和细胞培养试验研究,结果表明,雷公藤多苷治疗RA具有疗效,其作用机制可能与通过降低VEGF和VEGFR2表达水平,有效抑制血管生成有关。本实验研究的创新性体现在：(1)近年来对VEGF的研究较多,但对其基因表达的研究常采用分子杂交和常规RT-PCR等半定量的方法,其定量的准确性不足,变异也比较大,进而对研究结论的可靠性有一定的影响。本研究建立的检测大鼠组织中VEGF和VEGFR2 mRNA的实时荧光定量PCR方法,首次将绝对定量与相对定量结合,其定量分析的准确度和灵敏度均远高于以前的方法。(2)对健康大鼠不同部位组织VEGF特异性表达进行了检测分析,为以后研究在疾病大鼠模型中表达水平奠定了基础,国内外尚未见报道。(3)首次应用实时荧光定量PCR的方法进行VEGFR2 mRNA的检测。(4)雷公藤作为目前治疗类风湿关节炎药物中疗效最被肯定的单味中药,其抗炎、免疫抑制作用的研究比较深入,但抗血管生成作用机制以及相关动物实验研究较少,本研究通过动物实验、细胞培养试验,比较系统地分析了雷公藤多苷干预RA的抗血管生成作用,阐明其通过下调VEGF和VEGFR2表达水平,有效抑制血管生成的作用机制。