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背景：原发性肝癌为全球常见的恶性肿瘤之一,由于其高侵袭性和高复发率,肝癌已经位居世界癌症死因的第二位。肝癌转移是引起患者死亡的主要原因。因此,加强对肝癌转移机制的研究,发现阻止肝癌转移的方法成为了肝癌治疗的重中之重。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮细胞表型向间质细胞表型转化的过程。很多研究已经证实,EMT在肿瘤的发生过程中发挥了重要作用,特别是在很大程度上促进恶性肿瘤的远处转移。因此,对肝癌细胞EMT的研究为肝癌转移机制的研究提供了新的思路。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)是存在于肿瘤细胞中的一小部分细胞,它们具有自我更新、分化、致瘤等有别于普通肿瘤细胞的特殊生物学特性。很多研究发现,肿瘤干细胞是导致恶性肿瘤复发、耐药以及转移的罪魁祸首。因此,探索肿瘤干细胞在肿瘤发生发展过程中的作用机制,可能为肝癌的治疗发现新的作用靶点。MicroRNAs (miRNAs)是一类长度大约19～22个核苷酸的非编码小RNA片段,在人体的各种生命活动发挥重要作用。现在普遍认为,miRNAs在恶性肿瘤的发生过程中发挥重要调控作用,它们可以发挥促癌或抑癌的作用。迄今为止,已经发现很多miRNAs可以调控肿瘤细胞EMT和CSCs的获得,包括miR-155。但是,miR-155在肝癌细胞EMT及干细胞表型获得中的作用及机制还未见相关报道。因此,研究miR-155在肝癌细胞EMT及干细胞表型获得中的作用及机制,对进一步发现肝癌转移的机制具有重要意义。第一部分miR-155对肝癌细胞EMT及CSCs获得的调控作用目的：1.利用无血清干细胞培养基富集肝癌干细胞,比较miR-155在肝癌干细胞和非干性肝癌细胞中的表达差异。2.探讨过表达miR-155对肝癌细胞EMT及CSCs获得的调控作用。方法：1.我们首先利用无血清干细胞培养基悬浮培养MHCC-97H肝癌细胞,连传3代,利用流式细胞仪、qPCR检测富集细胞球中肝癌干细胞标志物CD90、CD133. Oct4以及miR-155的表达情况,分析miR-155与干细胞标志物表达的相关性。2.我们利用慢病毒载体构建miR-155/miR-NC稳定过表达细胞株后,利用qPCR、Western blot检测EMT相关基因E-cadherin、N-cadherin、 vimentin的表达差异,利用transwell侵袭／迁移实验检验两组细胞侵袭、迁移能力的差异；利用流式细胞仪、qPCR检测干细胞相关标志物CD90、CD133、Oct4的表达差异,利用成球实验验证两组细胞成球能力的差异。结果：1.利用无血清培养基悬浮培养肝癌细胞2周后,可见大量细胞球形成；与普通培养基中贴壁细胞相比,细胞球中CD90、CD 133、Oct4明显高表达,并且miR-155表达也明显高于普通贴壁细胞。2.miR-155过表达明显下调了E-cadherin的表达,而上调了N-cadherin和vimentin的表达,并且增强了细胞的侵袭和迁移能力；同时,miR-155过表达增加了CD90+、CD133+细胞的比例,干细胞相关基因Oct4表达也明显增加,并且显著提高了癌细胞的成球能力。当我们用miR-155-inhibitor抑制稳定过表达细胞株中的miR-155后,结果则恰恰相反。结论：miR-155在肝癌细胞EMT及CSCs的获得过程中发挥了重要的调控作用。第二部分 miR-155通过靶向TP53INP1促进肝癌细胞EMT及干细胞表型的获得目的：1.验证在肝癌细胞中miR-155是否能够靶向调控基因TP53INP1的表达。2.验证抑癌基因TP53INP1是否参与了调控肝癌细胞EMT及干细胞表型获得。3.验证miR-155调控肝癌细胞EMT及干细胞表型的获得是否是通过靶向调控其靶基因TP53INP1的表达而起作用。方法：1.我们通过转染miR-155 mimic过表达肝癌细胞MHCC-97H和HepG2中的miR-155后,利用qPCR、western blot检测TP53INP1的表达变化。2.为了抑制TP53INP1的表达,我们将siRNA转染入MHCC-97H和HepG2细胞中,利用qPCR、western blot检测EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin、vimentin,干细胞相关标志物CD90、CD133、Oct4的表达,并利用流式细胞术检测CD90+、CD133+细胞比例的变化。3.为了验证miR-155是通过靶向抑制TP53INP1而发挥作用的,我们将MHCC-97H细胞分为4组,并按以下组合进行转染：①miR-155-inhibitor-NC+siRNA-NC ② Mir-155-inhibitor+ TP53INP1-siRNA-NC ③ miR-155-inhibitor-NC+TP53INP1-siRNA ④ Mir-155-inhibitor+TP53INP1-siRNA。利用qPCR、western blot检测以上四组细胞中EMT相关标志物和干细胞相关标志物Oct4的表达差异。结果：1.过表达肝癌细胞MHCC-97H和HepG2中的miR-155可以明显抑制TP53INP1的表达变化。2.抑制TP53INP1的表达后,我们发现EMT相关标志物E-cadherin明显下调,而N-cadherin和vimentin则明显上调,肝癌干细胞标志物CD90、CD133、Oct4的RNA水平也明显升高,并且CD90+、CD133+细胞比例有所提高。3.我们发现共转染miR-155-inhibitor和TP53INP1-siRNA的细胞组,siRNA在一定程度上了减弱了miR-155-inhibitor对肝癌干细胞标志物Oct4及EMT的抑制。结论：miR-155通过靶向抑制其靶基因TP53INP1促进肝癌细胞EMT及干细胞表型的获得。第三部分TGF-p1通过miR-155下调TP53INP1对肝癌细胞EMT及CSCs获得进行调控目的：1.验证TGF-β1对肝癌细胞EMT及干细胞表型获得的调控作用。2.验证TGF-β1是否可以诱导肝癌细胞中miR-155的表达,并验证TGF-p1是否可以抑制TP53INP1的表达。3.验证TGF-p1抑制TP53INP1的表达是通过对miR-155 的调控而实现的。方法：1.TGF-β1加入肝癌细胞培养基中培养一段时间后,观察细胞形态变化,利用qPCR、western blot检测EMT相关标志物E-cadherin、 N-cadherin,干细胞相关标志物CD90. CD133、Oct4的表达。2. TGF-p1处理肝癌细胞后,用qPCR检测miR-155和TP53INP1的表达变化。3.为了验证TGF-p1抑制TP53INP1的表达是通过对miR-155的调控而实现的,我们将细胞分为三组,并按以下组合处理肝癌细胞：①TGF-p1+miR-155-inhibitor ② TGF-p1+miR-155-inhibitor-NC ③ NC。利用qPCR、western blot检测以上三组细胞中TP53INP1的表达差异,并检测EMT相关标志物和干细胞相关标志物Oct4的表达差异。结果：1.TGF-p1诱导后,肝癌细胞形态发生明显变化,EMT相关标志物E-cadherin明显下调,而N-cadherin则明显上调,肝癌干细胞标志物CD90. CD133、Oct4的RNA水平也明显升高。2. TGF-p1诱导肝癌细胞后,我们发现TP53INP1表达下调,并且miR-155表达明显上调。3.我们发现miR-155 inhibitor不仅可以在一定程度上减弱TGF-p1对TP53INP1的抑制,而且还可以减弱TGF-p1对肝癌细胞EMT的诱导作用,并且TGF-p1对肝癌干细胞标志物Oct4的促进作用也被miR-155 inhibitor抑制。结论：TGF-p1通过上调miR-155下调TP53INP1进而促进肝癌细胞EMT及获得CSCs表型。