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金铁锁PsammosilenetunicoidesW.C.WuetC.Y.Wu是石竹科(Caryophyllaceae)单种属金铁锁属植物,分布于云南,贵州、四川和西藏等省,主产于云南西北部、中部和东北部,为国家二级保护植物,是“云南白药”的主要组成药材之一。长期以来,金铁锁完全靠野外采挖,加之自然生长缓慢,因而野生资源迅速减少,自然产量大幅降低。金铁锁资源已经不能满足“云南白药”等中成药的需求。金铁锁的有效成分为金铁锁皂苷(主要是三萜皂苷)。β-香树素合成酶(β-AS)是三萜皂苷合成途径中的关键酶,它催化三萜类化合物的合成。针对有效部位(三萜类皂苷)生物合成途径中关键调节酶:金铁锁β-香树素合成酶(β-AS)的cDNA的分离、原核表达和功能鉴定等进行研究,通过RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)等方法克隆其全长cDNA,结合大肠杆菌的原核表达得到目的蛋白,得到以下结果:
1.提取了金铁锁根部总RNA,并经RT-PCR和RACE等方法分离得到金铁锁三萜皂苷生物合成途径中的关键酶基因:β-香树素合成酶全长cDNA,全长2882bp,ORF长2284bp,编码760个氨基酸。
2.构建了β-香树素合成酶基因大肠杆菌的表达系统,通过大肠杆菌BL21(DE3)表达了β-香树素合成酶,大小为87KD左右,与预测结果一致。
以上研究为保证金铁锁资源的可持续利用及为金铁锁次生代谢工程研究奠定了重要基础。