HLA(HumanLeukocyteAntigen，HLA)是具有高度多态性的人类免疫遗传基因，在非血缘造血干细胞移植(UnrelatedHematopoieticStemCellTransplantation，UHSCT)中参与抗原递呈等移植免疫应答反应。HLA-Ⅰ类基因座位为HLA-A、B、C：HLA-Ⅱ类基因为HLA-DR、DQ、DP。HLA基因为紧密连锁的复等位基因，呈单倍体(haplotype)遗传方式，并表现出显著的连锁不平衡(LinkageDisequilibrium，LD)状态。UHSCT受到移植后移植物抗宿主病(GraftVersusHostDisease，GVHD)的局限，因此全球范围内采用高分辨，即4位数编码等位基因分型作为UHSCT前的供体选择的标准。本文在研究序列分析基础上(SequenceBasedTyping，SBT)进行57人非血缘造血干细胞捐献者高分辨的HLA等位基因分型，同时采用PCR-SSP作为等位基因分析对照实验，并将PCR-SBT与PCR-SSP高分辨技术进行方法学比较。HLA-A*02-B*46是中国汉族人群最常见的单倍体之一，HLA基因单倍体的研究通常以家系分析得到或者随机群体计算连锁不平衡参数，本文对88人单体纯合子研究可以从一个侧面分析不同人群HLA单体型分布情况，可以为UHSCT提供信息。PCR-SBT是HLA等位基因高分辨分析的方法，HLA等位基因高分辨相合可以降低UHSCT后GVHD的发生率。本研究旨在以HLA-A*02-B*46单倍体低分辨纯合子为研究对象，采用PCR-SBT进行HLA-A*02-B*46单倍体等位基因高分辨分析，统计和分析HLA-A*02-B*46单倍型在中国汉族人群中的多态性及其连锁不平衡。本课题研究分为两部分： 第一部分PCR-SBT基础上高分辨水平HLA-A、B、DRB1等位基因分型技术研究 目的:为了预测无血缘HSCT后GVHD的发生及程度和选择相容的干细胞捐献者，通过PCR-SBT的方法，提高HLA基因分型的准确性和分辨水平。 材料和方法:研究对象是2003年8月至2004年12月间无血缘关系的中国汉族人群造血干细胞捐献者随机选取57人，年龄在18-55岁间。采用Qiagen试剂盒提取全血基因组DNA样品，并用紫外分光光度计测量其纯度和浓度。采用PCR-SBT分别对57个捐献者血样进行HLA-A、B和DRB1位点的高分辨等位基因分型。作者合成了分别用于HLA-A、B、DRB1分型的A位点8条引物，B位点6条和DRB1位点22条PCR扩增引物和SBT测序反应引物，以及一对PCR扩增内对照引物，经优化改良后成套，可对2002年WHO-HLA系统因子命名委员会公布命名的HLA-A、B和DRB位点等位基因进行测序分型，进行HLA-A、B和DRB1位点的等位基因高分辨分析。采用PEL-FREEZ公司PCR-SSP高分辨引物作为实验技术对照，同时对57份DNA进行等位基因分型。 结果:PCR-SBT实验中有15份(26％)DNA的基因分析结果呈多组合，PCR-SSP实验中有8份(14％)DNA的等位基因高分辨分析结果呈多组合。经两种方法相互佐证实验后，57份样本均获得结果一致、清楚和精确地HLA-A、B、DRB1位点高分辨基因分型。 结论:PCR-SBT提高HLA等位基因高分辨分析的准确性，同时能提高HLA等位基因高分辨分析的精确度。PCR-SSP和PCR-SBT是HLA等位基因高分辨分析的方法，由于原理不同，均会产生不同差异结果，两种方法具有实验互补意义。PCR-SBT可直接阅读基因序列，对新等位基因有较强的分析优势，而PCR-SSP对于已知序列有较稳定的识别能力。 第二部分：HLA-A*02-B*46单倍体等位基因的多态性分布频率研究 目的:了解HLA-A*02-B*46单倍体在中国汉族人群中的等位基因多态性以及高分辨水平在不同地域分布情况，掌握各种多态性等位基因在中国汉族人群中的相对频率，为UHSCT选择合适的供者以提高存活率以及降低GVHD的发生。 材料和方法:研究对象是1995年8月至2004年12月间中国汉族人群无血缘造血干细胞捐献者，年龄在18-55岁间，第一组：HLA-A*02-B*46单倍体低分辨基因分型均是纯合子，其中南方人群48人，北方人群40人。第二组：选取HLA-A*02-B*46(-)，其中南方汉族个体60人，北方个体60人。采用Qiagen试剂盒提取全血基因组DNA样品，并用紫外分光光度计测量其纯度和浓度，采用PCR-SBT方法对HLA-A*02和HLA-B*46等位基因进行测序分析。最终分型结果计算相对频率，并比较南北汉族人群的地域差异，采用X2检验统计学分析。 结果:第一组中，南北汉族人群HLA-A*02-B*46单倍体表现多样性，共检出4种HLA-A*02等位基因(A*020101、A*0203、A*0206、A*0207)，B*46检出1种等位基因(B*4601)。在南方人群中，A*0207为优势等位基因基因，分布频率是79.2％，其它等位基因分布频率依次是A*0201(13.5％)、A*0203(4.2％)、A*0206(3.1％)，在北方汉族人群中，A*0207是分布频率高(75.O％)，其它等位基因分布频率依次是A*020101(15.0％)、A*0206(6.2％)、A*0203(3.8％)。在第二组中，共检出6种等位基因(A*020101、A*0203、A*0205、A*0206、A*0207、A*0210)，优势基因均是A*0201，且各种等位基因在南北人群中无差异，发现有在单倍体中未出现A*0205等位基因。HLA-A*02-B*46单倍体等位基因高分辨呈现低度杂合性。南北两个群中HLA-A*02-B*46单倍体等位基因总体分布以及4种等位基因相对频率无显著性差异。 结论:HLA-A*02-B*46单倍体等位基因在高分辨水平上表现多样性，主要表现在A*02等位基因的多样性，HLA-A*0207-B*4601是中国汉族人群HLA-A*02-B*46单倍体中最为常见的多态性单倍体，且南北人群中分布规律相似。