多种生物多肽的体外抗肿瘤筛选及鱼皮多肽的纯化与鉴定

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目的:对多种生物多肽(壁虎多肽、北虫草多肽、灰树花多肽、鱼皮多肽)进行体外抗肿瘤筛选,确定其抗肿瘤效果。对有效果的吉鲡鱼鱼皮多肽进行分离纯化,并对分离出的样品进行抗肿瘤效果验证,最终得到具有抗肿瘤效果的纯品多肽,并初步确定其结构。方法:采用MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)法计算肿瘤细胞的抑制率来反映被测样品对肿瘤细胞抑制作用的大小,MTT法测定生物多肽对正常细胞的影响。采用Sephadex G-50、Sephadex LH-20凝胶柱分离吉鲡鱼鱼皮多肽,得到进一步纯化的鱼皮多肽,流动相为水;运用蛋白质分析仪分段接收单一峰,得到纯品多肽,所用缓冲液为25mmol/LTris-HCl和150mmol/L NaCl,检测波长为280nm。运用HPLC对分离得到的多肽组份进行定性分析,流动相为甲醇和水(10:90);运用反相硅胶柱纯化最终纯品多肽,一开始用1%乙酸置换除盐,然后用纯甲醇将剩余多肽冲出;运用MAILD-TOF-MS质谱、核磁共振波谱法检测纯品多肽的结构。结果:MTT法测定多种生物多肽对食管癌(Eca109)细胞的抑制作用,壁虎多肽为1μg/mL的抑制率为(42.83±4.88)%,北虫草多肽10μg/m的l抑制率为(38.34±0.54)%,灰树花多肽5μg/ml的抑制率为(42.78±4.10)%,吉鲡鱼鱼皮多肽高剂量(原液-水,1:1)的抑制率为(86.78±2.72)%。测定对对乳腺癌(MCF-7)细胞的抑制作用,壁虎多肽1μg/ml的抑制率为(50.15±2.16)%;北虫草多肽10μg/ml的抑制率为(54.11±3.92)%,灰树花多肽100μg/ml的抑制率为(63.13±2.27)%,吉鲡鱼鱼皮多肽高剂量(原液-水,1:1)的抑制率为(91.55±2.37)%。测定对胃癌(SGC-7901)细胞的抑制作用,壁虎多肽0.1μg/ml的抑制率为(21.97±5.04)%;北虫草多肽1μg/ml的抑制率为(35.32±8.37)%,灰树花多肽100μg/ml的抑制率为(18.68±2.73)%。测定对肺腺癌(A549)细胞的抑制作用,壁虎多肽50μg/ml的抑制率为(35.57±2.64)%,北虫草多肽5μg/ml的抑制率为(38.29±5.52)%,灰树花多肽10μg/ml的抑制率为(20.18±6.58)%,吉鲡鱼鱼皮多肽高剂量(原液-水,1:1)的抑制率为(90.07±0.69)%。测定对肝癌(Bel7402)细胞的抑制作用,壁虎多肽5μg/ml的抑制率为(46.02±6.48)%;灰树花多肽100μg/ml的抑制率为(44.52±5.37)%。测定对结肠癌(HT29)细胞的抑制作用,灰树花多肽50μg/ml的抑制率为(19.7±7.97)%,其他生物多肽对其无明显的抑制作用。测定对正常大鼠骨髓干细胞的抑制作用,壁虎多肽100μg/mL的存活率为(114.08±4.88)%,北虫草多肽10μg/m的存活率为(60.11±6.79)%,灰树花多肽100μg/mL的存活率为(61.50±15.25)%,吉鲡鱼鱼皮多肽中剂量(原液-水,1:3)的存活率为(104.65±21.48)%;测定对正常大鼠肾小球系膜细胞的抑制作用,壁虎多肽100μg/mL的存活率为(62.18±4.43)%,北虫草多肽100μg/m的存活率为(31.99±1.73)%,灰树花多肽100μg/ml的存活率为(166.19±7.73)%,吉鲡鱼鱼皮多肽中剂量(原液-水,1:3)的存活率率为(101.23±11.46)%。吉鲡鱼鱼皮多肽纯化后纯品多肽对肺腺癌细胞的抑制作用在200μg/mL时为(17.49±13.26)%。有效纯品多肽初步结构为:结论:中药是我国的精粹之一,在此之前已经有足够的研究,从其中筛选具有相应疗效(如活血化瘀、清热解毒等)的药物要比盲目的选择药物来筛选成功率高。本课题所选的壁虎多肽、北虫草多肽、灰树花多肽、吉鲡鱼鱼皮多肽均具有广谱抗肿瘤作用,且这种抑制作用具有一定选择性,满足成药的基本条件。其中吉鲡鱼鱼皮多肽的抗肿瘤效果重复性好且与浓度线性相关,对正常细胞没有明显的抑制作用,因而进行了进一步分离纯化,得到的纯品多肽也有一定的抗肿瘤活性,为以后开发新药提供了一定的理论支持。
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