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实验目的1.观察不同时期1型糖尿病对小鼠骨代谢的影响并探索其机制2.观察骨髓脂肪组织在早期1型糖尿病小鼠骨吸收增强中的作用及机制实验方法第一部分:不同时期的1型糖尿病对小鼠骨代谢的差异性作用1.以13周龄雄性C57BL/6J小鼠为对象,随机分组为健康对照组(Control组)、早期1型糖尿病组(Early stage of type 1 diabetes mellitus,ES-T1DM组)和晚期1型糖尿病组(Late stage of type 1 diabetes mellitus,LS-T1DM组)。ES-T1DM组和LS-T1DM组首先通过连续注射5天腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)50mg/kg/d,建立1型糖尿病模型,同时Control组接受同等剂量的缓冲液注射。在建模成功后2周对早期1型糖尿病组和健康对照组进行取材,在建模成功后12周对晚期1型糖尿病组进行取材;2.建模成功后每天检测各组小鼠血糖值和体重;3.通过ELISA检测血清的骨代谢相关标志物水平;4.使用Micro-CT扫描观察小鼠各部位(股骨远端、胫骨近端以及腰椎作为松质骨,股骨中段作为皮质骨)骨组织形态和骨量变化;5.通过对骨组织脱水包埋后石蜡切片进行H&E染色分析骨组织形态;6.通过对骨组织脱水包埋后石蜡切片进行TRAP染色分析骨组织形态计量;7.通过实时定量PCR检测成骨细胞和破骨细胞标志物的基因表达;第二部分:骨髓脂肪组织在早期1型糖尿病小鼠骨吸收增强中的作用及机制1.以13周龄雄性C57BL/6J小鼠为对象,随机分组为健康对照组(Control组)、早期1型糖尿病组(T1DM组)和早期1型糖尿病处理组(Type 1 diabetes treated by Bisphenol A diglycidyl ether,T1+BADGE组)。T1DM组和T1+BADGE组首先通过连续5天腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)50mg/kg/day,建立1型糖尿病模型。建模成功的同时,T1+BADGE组开始为期2周的BADGE处理(每天腹腔注射,30 mg/kg/d),其余两组接受相同剂量的缓冲液注射。在建模成功后2周对健康对照组、早期1型糖尿病组和早期1型糖尿病治疗组进行后肢骨取材和血清提取;2.通过ELISA检测血清的骨代谢相关标志物水平;3.使用Micro-CT扫描观察小鼠长骨骨组织形态和骨量变化;4.通过对骨组织脱水包埋后石蜡切片进行H&E染色分析骨组织形态和骨髓脂肪细胞数量;5.通过对骨组织脱水包埋后石蜡切片进行TRAP染色分析破骨细胞数量及形态;6.通过实时定量PCR检测成脂因子、成骨细胞和破骨细胞标志物的基因表达;7.通过免疫组织化学染色观察成骨细胞和破骨细胞标志物的蛋白表达;实验结果第一部分:不同时期1型糖尿病小鼠的骨表型和骨代谢差异1.成功建立1型糖尿病小鼠模型,主要表现为成模小鼠随机血糖高于16.7mmol/L,并出现多尿、多饮、多食以及体重明显下降的糖尿病典型症状;2.通过Micro-CT检测,与Control组相比,ES-T1DM组和LS-T1DM组小鼠都表现出明显的骨量降低,但ES-T1DM组小鼠主要表现在长骨松质骨骨量下降,皮质骨骨量无明显变化,而LS-T1DM组小鼠的松质骨和皮质骨骨量均明显降低;3.在ES-T1DM组和LS-T1DM组小鼠中,长骨松质骨的骨量下降程度比椎体松质骨更大;4.与Control组相比,ES-T1DM组和LS-T1DM组小鼠的骨形成均受到抑制,而ES-T1DM组小鼠骨吸收增强,LS-T1DM组小鼠骨吸收减弱;5.对骨组织提取RNA进行实时荧光定量PCR,与Control组相比,ES-T1DM组小鼠的成骨细胞标志物表达ALP、RUNX2受到抑制,破骨细胞标志物CTSK、MMP-9表达增加,但RANKL、OPG的表达无明显变化;而LS-T1DM组小鼠的成骨细胞标志物和破骨细胞标志物的表达均受到不同程度抑制。第二部分:骨髓脂肪组织增多是早期1型糖尿病小鼠骨吸收增强的原因1.T1DM小鼠的长骨中骨吸收增强,但骨组织RANKL mRNA表达无明显变化;2.T1DM小鼠的长骨中BMAT显著增加,并主要分布在干骺端;3.T1DM小鼠BMAT中RANKL的表达显著增加,并位于脂肪细胞膜上;4.BADGE处理后的T1DM小鼠骨吸收减弱,骨髓脂肪组织显著减少并且其RANKL表达降低;5.BADGE不能通过促进骨形成改善T1DM小鼠骨量;结论1.早期和晚期1型糖尿病小鼠均会出现骨量下降,但早期主要集中在长骨松质骨,而晚期才会出现皮质骨骨量下降;2.早期和晚期1型糖尿病小鼠的骨代谢有明显差异性,骨形成持续抑制,而骨吸收早期增强,晚期减弱;3.早期1型糖尿病小鼠骨吸收增强,通过RANKL/OPG调控破骨细胞活动的主要是骨髓脂肪组织,而非骨组织本身;4.BADGE抑制骨髓脂肪化导致骨吸收下降,但不能逆转1型糖尿病对骨形成的抑制作用。