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第一部分顺铂诱导肿瘤细胞发生ferroptosis及其机制的初步探讨目的观察顺铂诱导肿瘤细胞发生ferroptosis的现象,初步探讨其作用机制。方法1.人非小细胞肺癌细胞株A549、H460、H358、Calu-1,人结肠癌细胞株HCT116和人纤维肉瘤细胞株HT1080,分别与化疗药物顺铂、多柔比星、5-氟尿嘧啶、紫杉醇和柳氮磺胺嘧啶治疗及ferroptosis特异性抑制剂ferrostatin-1共同培养。MTT法检测细胞活力,同时观察凋亡抑制剂z-vad-fmk、坏死抑制剂necrostatin-1、自噬抑制剂chloroquine、ferroptosis抑制剂ferrostatin-1及铁螯合剂deferoxamine能否逆转顺铂的细胞毒作用。2.透射电子显微镜观察顺铂处理后HCT116细胞超微结构的变化。3.流式细胞术检测顺铂处理后HCT116细胞内ROS水平的变化。4. SiRNA沉默HCT116细胞ferroptosis相关基因IREB2, MTT法检测其经顺铂处理后细胞活力的变化。5.生化法检测顺铂处理后HCT116细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases, GPXs)活性的变化。结果1.顺铂对A549细胞和HCT116细胞的生长抑制作用可以被ferroptosis特异性抑制剂ferrostatin-1(fer-1)部分逆转(细胞活力HCT116细胞：顺铂组=34.70±2.06%,顺铂+fer-1组=46.79±2.84%；A549细胞：顺铂组=57.99±3.07%,顺铂+fer-1组=65.23±3.37%,P<0.05)；铁螯合剂deferoxamine、ferroptosis抑制剂ferrostatin-1和凋亡抑制剂z-vad-fmk均可部分逆转顺铂对HCT116细胞的生长抑制作用,而坏死抑制剂necrostatin-1和自噬抑制剂chloroquine则无此作用。2.顺铂处理的HCT116细胞出现ferroptosis特异性超微形态改变：线粒体明显皱缩及双层膜密度增加。3.顺铂作用后HCT116细胞内ROS水平增高,而ferroptosis特异性抑制剂β-ME可明显抑制上述改变。4. SiRNA沉默IREB2基因后,顺铂对HCT116细胞的细胞毒作用明显减弱。5.顺铂可明显降低HCT116细胞内GSH含量,并导致GPXs活性下降。结论1.顺铂对肿瘤细胞的生长抑制作用可以被ferroptosis抑制剂部分逆转,同时顺铂可以导致肿瘤细胞出现ferroptosis特异性的超微形态改变,引起ferroptosis相关的ROS水平增加,表明其可以诱导肿瘤细胞发生ferroptosis。2.靶向沉默ferroptosis相关基因IREB2可明显减少顺铂诱导的HCT116细胞的死亡；3.顺铂通过减少细胞内GSH含量,降低GPXs活性来诱导肿瘤细胞发生ferroptosis。第二部分Erastin、沉默GPX4与顺铂的协同抗肿瘤作用目的Ferroptosis具有独特的形态特征、基因表达、分子通路和严密的调控系统,可能是肿瘤治疗的一个新思路。本研究拟观察ferroptosis激活剂erastin、靶向沉默GPX4与顺铂的协同抗肿瘤作用。方法MTT法检测ferroptosis激活剂erastin联合顺铂对HCT116及A549细胞活性的影响,流式细胞术检测细胞内ROS的变化,生化法检测细胞内GSH含量的变化及GPXs酶活性的变化。MTT法检测siRNA沉默GPX4联合顺铂对HCT116细胞活性的影响,流式细胞术检测细胞内ROS的变化,生化法检测细胞内GSH含量的变化及GPXs酶活性的变化。结果Erastin联合顺铂组HCT116及A549的细胞活力显著低于erastin组和顺铂组。相比erastin组和顺铂组,erastin联合顺铂组可显著增加细胞内ROS水平,减少GSH含量及GPXs酶活性。Ferroptosis抑制剂β-ME及ferrostatin-1能比凋亡抑制剂z-vad-fmk更有效的逆转erastin联合顺铂对肿瘤细胞的生长抑制作用。SiRNA沉默GPX4联合顺铂组,HCT116细胞活力显著低于siRNA沉默GPX4组和顺铂组。结论Erastin、siRNA沉默GPX4可诱导ferroptosis,明显增加顺铂的细胞毒作用,产生协同抗肿瘤作用。