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研究背景:创伤、拔牙、感染等原因造成的骨缺损是临床亟待解决的难题之一。临床上骨缺损的修复方法主要包括骨搬运术、骨移植等手术治疗以及物理疗法。众所周知,骨搬运术的手术复杂、易伴发感染;自体骨移植的骨源受限,对供体造成新的骨缺损;异体骨移植易诱发排异反应。因此,寻找一种并发症少、利于成骨、操作简单的修复方法可能会为临床骨缺损的治疗提供新的方向。课题组先前的研究发现,运用化学疗法治疗骨缺损方法较为安全、简单、有效。1α,25-dihydroxyvitamin D3(1,25(OH)2D3)是维生素 D 的一种活性形式,明显抑制绝经后骨质疏松。骨质疏松是以骨量减少和骨微结构破坏为特征的一组全身性骨骼疾病,而骨量的减少主要是由于骨吸收所致。科研人员发现活性维生素D能够明显降低骨质疏松患者骨折的风险。近年来,众多的活性维生素D类似物在原有的药物基础上进行了药学性能的优化。本课题中所使用的艾地骨化醇(Eldecalcitol,ELD)是一种新型活性维生素D类似物,其与维生素D受体(Vitamin D receptor,VDR)的亲和力较低,而与维生素D结合蛋白(Vitamin D binding protein,DBP)的亲和力较高。因此,艾地骨化醇具有作用持久和利用率高的特性。研究发现艾地骨化醇明显地抑制骨吸收以及增加骨密度,此外,艾地骨化醇可以诱导"迷你型塑造"骨形成,而不依赖破骨细胞的骨吸收过程。因此在2011年艾地骨化醇被批准为治疗骨质疏松症的药物。艾地骨化醇具有抑制骨吸收增加骨量的特性,因此艾地骨化醇在治疗骨质疏松症方面一直备受关注,但是其在骨缺损修复方面的研究甚少。骨缺损愈合是一个多细胞参与,多种信号在时间和空间上精密调控的复杂的生物学过程。与骨质疏松不同的是,骨缺损愈合不仅包括骨量的恢复,而且包括骨质的成熟。成骨细胞、破骨细胞和骨细胞是骨再生的三大功能细胞,在骨缺损愈合过程中扮演着不可替代的角色。因此,本课题利用艾地骨化醇抑制骨吸收的特性来治疗局部骨缺损,以期获得良好的治疗效果,并且建立骨缺损模型研究艾地骨化醇对三大功能细胞影响,从而探讨其对骨缺损愈合的影响,并期望该研究成果能为临床骨缺损的治疗提供一定的理论基础及新的思路。实验目的:本课题通过制备骨缺损模型,旨在探讨系统性应用艾地骨化醇对成骨细胞、破骨细胞、骨细胞的影响及其相关机制,弥补艾地骨化醇在骨缺损修复方面的研究空缺,为临床骨缺损的治疗提供一定的理论基础及新的思路。实验方法:将48只8周龄雄性Wistar大鼠(体重180-220g)随机分为对照组(CON组)和艾地骨化醇组(ELD组),每组24只。所有动物全麻后于双侧股骨中段分别制备大小为1mm×3mm×5mm(深度×宽度×长度)的骨缺损,并在骨缺损表面覆盖胶原膜。ELD组术后通过灌胃方式给予艾地骨化醇(剂量为50ng/kg),CON组投给等量的脂肪酸,隔日给药一次。24只大鼠分别于术后1、2、4和8周处死并取材(n=6),提取蛋白和mRNA,利用Western blot检测RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,核因子 kB 受体活化因子配体)、OPG(Osteoprotegerin,骨保护素)和OCN蛋白的表达情况;利用RT-PCR检测RANKL、OPG和OCN mRNA的表达水平。24只大鼠分别于术后1、2、4和8周处死并取材(n=6),经石蜡包埋后制备5μm的连续切片。通过HE染色进行新生骨大体形态学观察;通过马松染色检测新生骨中非成熟骨组织所占比例;通过TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色方法检测破骨细胞数目;利用免疫组织化学染色方法检测 ALP(Alkaline phosphatase,碱性磷酸酶)、CK(CathepsinK,组织蛋白酶 K)、OCN(Osteocalcin,骨钙素)、DMP1(Dentin matrix protein 1,牙本质基质蛋白1)和FGF23(Fibroblast growth factor23,成纤维生长因子23)的表达情况。本课题通过检测上述因子,探讨艾地骨化醇对骨形成以及骨矿化的影响。实验结果:1.ELD增加新生骨骨量骨缺损区域HE染色结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),大量纤维结缔组织和新生编织骨充填整个骨缺损部位,ELD组新生编织骨骨量明显高于CON组;在骨缺损愈合的后期(4、8周),4周ELD组新生骨骨量高于CON组,8周CON组和ELD组之间骨量无明显差异。2.ELD对成骨和破骨功能的影响骨缺损区域ALP/TRAP双重染色结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),ELD组ALP的表达明显多于CON组。CON组TRAP阳性破骨细胞数目明显高于ELD组,破骨细胞深染、体积大且呈现多核,提示破骨功能活跃;在骨缺损愈合的后期(4、8周),ELD组ALP的表达多于CON组,CON组TRAP阳性破骨细胞数目有所降低但仍然高于ELD组。骨缺损区域CK免疫组织化学染色结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),CON组CK阳性破骨细胞数目明显多于ELD组,并且ELD组的CK阳性破骨细胞与骨组织表面附着不甚紧密,体积较小胞体扁平;在骨缺损愈合的后期(4、8周),CON组CK阳性破骨细胞数目有所减低但仍然高于ELD组。骨缺损区域RANKL、OPG蛋白的Western blot结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周)和后期(4、8周),与CON组相比,ELD组RANKL蛋白的表达水平明显降低,OPG蛋白的表达水平明显上调,并且ELD组RANKL/OPG的比例明显降低。骨缺损区域RANKL、OPG mRNA的RT-PCR结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周)和后期(4、8周),ELD明显地下调RANKLmRNA的表达,促进OPG mRNA的表达,并且ELD组RANKL/OPG的比例显著降低。3.ELD对新骨成熟程度的影响骨缺损区域马松染色结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),1周CON组和ELD组之间未成熟骨组织所占比例(COI/TV)无明显差异,2周CON组未成熟骨组织所占比例(COL/TV)高于ELD组;在骨缺损愈合的后期(4、8周),ELD组骨缺损部位可见大量带状红染的成熟骨组织,并且新生骨裂缝较少骨质平滑细密,ELD组的未成熟骨组织的比例(COL/TV)明显低于CON组。4.ELD对成骨细胞矿化因子的影响骨缺损区域OCN免疫组织化学染色结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),1周CON组和ELD组骨基质OCN的表达无明显差异,2周ELD组成骨细胞胞质内OCN的表达明显多于CON组;在骨缺损愈合的后期(4、8周),ELD组OCN主要分布在骨基质中且表达量明显高于CON组。骨缺损区域OCN蛋白的Western blot结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周),1周CON组和ELD组OCN的表达无明显差异,2周ELD组OCN蛋白的表达较CON组有所增加;在骨缺损愈合的后期(4、8周),ELD组OCN蛋白的表达水平明显高于CON组。骨缺损区域OCNmRNA的RT-PCR结果显示:在骨缺损愈合的早期(1、2周)和后期(4、8周),ELD明显促进OCNmRNA的表达。5.ELD对骨细胞矿化因子的影响骨缺损区域DMP1免疫组织化学染色结果显示:在骨缺损愈合的后期(4、8周),CON组骨细胞排列较紊乱,而ELD组的骨细胞排列较为整齐有序,ELD组的DMP1阳性骨细胞数目显著多于CON组。骨缺损区域的FGF23免疫组织化学染色结果显示:在骨缺损愈合的后期(4、8周),ELD组FGF23阳性骨细胞数目显著低于CON组。结论:1.艾地骨化醇一方面通过下调RANKL的表达,降低RANKL/OPG的比例,抑制破骨细胞生成和骨吸收;另一方面通过促进成骨细胞分化和骨形成,加速骨缺损的愈合。2.艾地骨化醇一方面通过促进成骨细胞矿化相关因子OCN的表达,促进新骨矿化;另一方面通过促进骨细胞矿化相关因子DMP1的表达,间接抑制骨细胞矿化相关因子FGF23的表达,促进新骨矿化,加速骨缺损愈合。