居泉沙雷菌(Serratia fonticola)是1979年被定义成沙雷菌属的一个新种,广泛分布于水、土壤、植物、人类以及动物的肠道和呼吸道中,是空气中的条件致病菌。该菌长期以来被认为对人体无害,但研究表明,居泉沙雷菌能引起人的腹泻、泌尿道感染、败血症和外科手术感染等,是引起医院内感染的重要条件致病菌。肠道沙门菌(Salmonella enterica)是我国进口动物源性饲料(鱼粉、肉粉、骨粉、肉骨粉、饲用血制品、配合饲料等)安全风险监控的高风险监控物质,其既能引起多种动物感染,也常引起人类食物中毒等群体爆发性事件。肠道沙门菌可分为6个亚种,分别为肠道沙门菌肠道亚种、肠道沙门菌萨拉姆亚种、肠道沙门菌亚利桑那亚种、肠道沙门菌双相亚利桑那亚种、肠道沙门菌浩敦亚种、肠道沙门菌迪卡亚种。肠道沙门菌广泛分布于自然界中,该病原在动物及其产品卫生方面存在较大危害性,对医学、兽医学和公共卫生均十分重要。在对进境饲料原料中进行沙门菌的日常检疫过程中,同属肠杆菌科沙雷菌属的居泉沙雷菌是主要干扰菌。本研究拟建立居泉沙雷菌和的肠道沙门菌双重实时荧光定量PCR检测方法,用于对进境饲料原料中居泉沙雷菌和的肠道沙门菌进行快速鉴别诊断,可以减少疑似沙门菌的后续生化和血清学鉴定步骤,提高进境饲料原料中沙门菌检测工作效率。分别以肠炎沙门氏菌invA基因和居泉沙雷氏菌gyrB基因为靶基因设计特异性的引物和Taqman水解探针。将pUCm-gyrB质粒标准品和pUCm-invA质粒标准品10倍梯度稀释后作为PCR反应的模板,分别建立检测居泉沙雷菌和的肠道沙门菌的实时荧光定量PCR方法,通过分析两种方法的特异性、灵敏度和重现性等评价所建立的荧光定量方法。特异性试验结果表明,针对居泉沙雷菌设计的单重荧光定量PCR方法,仅居泉沙雷菌能产生特异性的S型扩增曲线,而其他8种沙雷菌、10种沙门菌以及包括大肠杆菌在内的7种肠杆菌均不产生的扩增曲线。针对肠道沙门菌设计的单重荧光定量PCR方法,包括肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌在内的10种沙门菌均能产生特异性的S型扩增曲线,而9种沙雷菌以及包括大肠杆菌在内的7种肠杆菌均不产生的S型扩增曲线。敏感性试验结果表明,针对居泉沙雷菌和肠道沙门菌的单重荧光定量PCR方法其敏感性分别为145拷贝数/μL和197拷贝数/μL。标准曲线的相关系数分别为0.999和0.998,由此可知初始拷贝数的对数值与Ct值之间具有良好的相关性。重复性试验结果表明,建立的居泉沙雷菌实时荧光定量PCR方法和肠道沙门菌实时荧光定量PCR方法的变异系数分别不超过0.8%和0.6%。在分别检测两种病原体的实时荧光定量PCR方法的基础上,建立同时检测居泉沙雷菌和肠道沙门氏菌的双重实时荧光定量PCR方法,通过制作标准曲线确定建立的双重实时荧光定量方法的敏感性。由标准曲线可知,同时检测居泉沙雷菌和肠道沙门氏菌的实时荧光定量PCR方法其两条标准曲线的斜率和Y轴上的截距与分别检测两种病原菌的实时荧光定量PCR方法相比非常接近,且扩增效率无较大差异。由此可见,同时检测两种病原菌并不会出现交叉现象,建立的检测方法可用于日常检疫的工作。本研究对有效防范外来致病菌和采取有效检疫除害处理措施均具重要理论意义和实际应用价值。