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黄瓜（Cucumis sativus L.）是重要的蔬菜作物，世界各地都有广泛种植。黄瓜果实上多有果刺，常分为黑色和白色，市场上大多喜欢白刺品种。果刺颜色影响黄瓜商品品质，是外观品质育种的重要性状之一。 本研究利用黄瓜黑刺自交系S52、黑刺野生种 hardwickii（C. sativus var. hardwickii）和3个白刺材料S1003、WI1983G、397为试材构建3个遗传群体，BC1[(S52×S1003)×S1003]，F2(S52×WI1983G)，F2(hardwickii×397)，使用群体分组分析法（Bulked Segregant Analysis，BSA），对黄瓜刺色基因进行遗传分析与基因定位；使用14个不同遗传背景的黄瓜材料，包含4个黑刺材料（S52、WI7200、hardwickii、Lemon），10个白刺材料（S1003、WI1983G、397、419、Gy14、S06、316、9930、S61、S94），用于黑刺候选基因Csa4G003095序列多样性分析。 结果表明，S52、hardwickii中果实黑刺由显性单基因控制，利用3个群体均将 B定位于第4染色体的短臂上，最近两侧翼标记（SSRB-130和SSRB-107）与 B的遗传距离分别为2.01 cM和0.78 cM。序列分析发现，4个黑刺黄瓜材料的Csa4G003095推测编码的氨基酸序列没有差异（除 hardwickii仅有一个氨基酸变化），但10个白刺材料在该基因编码区的变异度很大，引起该基因编码蛋白的一小段或大段氨基酸缺失，功能缺失造成了刺色变异，验证了Csa4G003095即为黄瓜黑刺基因 B。同时，B基因侧翼标记InDelB01、SSRB-99、SSRB-130可用于黑刺辅助选择育种，准确率在97.9％以上，本研究为黄瓜黑色果刺育种利用及遗传机理阐明打下基础。