转基因动物是通过遗传工程手段对动物基因组的结构或组成进行人为的改造,并使改造后的基因在世代间可以传递和表达的动物。大部分转基因动物制备过程中不可避免的会使用来源于病毒或细菌的抗性基因,这些序列对目的基因的表达、受体动物以及转基因生物的安全等带来复杂的负面影响。为消除这些不利因素,本文以整合有loxP-neo-tk-loxP框架(LNKL)的转基因山羊耳成纤维细胞(Goat ear fibroblast,GEF)为研究对象,探索了通过Cre/loxP系统删除抗性基因的可行性,建立一套安全、高效的删除转基因山羊体内外源冗余序列的技术体系。首先,我们分离了乳汁内表达人溶菌酶的转基因山羊GEF(GEF-BLG-1和GEF-BLG-2),细胞大小、形态等未发现异常,抗性基因保留完整。通过电转和脂质体两种转染方法发现,pBS185质粒在GEF内的瞬间表达Cre重组酶能够引发LNKL的删除,但效率仅为0.8%,在挑取的515个克隆中,最后经PCR鉴定为抗性基因删除的细胞克隆只有4个。更重要的是所挑克隆,细胞老化严重,无法用于后续核移植以制备转基因山羊。随后,本文探索了通过蛋白转导Cre重组酶的方法删除抗性基因的可能性。包含有pET-cre质粒的大肠杆菌BL21(DE3),经0.1mM IPTG 37℃诱导3h后,表达了CRETAT,最高约占菌体总蛋白的48.6%。根据Cre重组酶的PI值约为10.3的特性,我们通过SP sepharoseTM和Source 15s两步阳离子交换色谱纯化出CRETAT, SDS-PAGE为单一条带。纯化的CRETAT经进一步缓冲液替换后进行体外活性测定,结果表明该蛋白能够有效将线形的pLNKL内的同向loxP位点间隔的序列切除。将纯化的CRETAT与GEF-BLG-2体外共同孵育,以介导GEF-BLG-2内DNA重组,删除LNKL序列。2μM CRETAT处理细胞,通过培养,挑克隆,G418敏感性实验,PCR鉴定以及Southern-blot鉴定,最终获得抗性基因删除的且保留了人溶菌酶基因表达框架的单细胞克隆。抗性基因删除效率为42%。另外,所得细胞克隆在增殖速度、形态、大小等方面,均与未处理细胞无明显差异。最后,为评估CRETAT的处理是否会影响体细胞克隆重构胚的发育潜能,我们将所得细胞进行体细胞核移植研究。研究发现,在融合率(0.88)、回收包埋卵率(0.78)以及囊胚发育率(0.30)等方面,CRETAT处理过的细胞均不低于未处理组(分别为0.64,0.52,0.09 )。综上所述,我们已经建立了一套可安全、高效的删除转基因山羊体内抗性基因的技术体系,即利用Cre/loxP系统,通过蛋白转导的方法在体外删除细胞基因组内同向loxP位点间的间隔序列,随后经体细胞克隆获得成活的动物。该方法的特点是删除效率高、适用细胞类型广、操作简单且不影响体细胞克隆的效率。目前,尚无此类相关研究报道。