右旋糖酐是蔗糖经右旋糖酐蔗糖酶催化聚合成的一种天然微生物活性多糖,不同分子量及结构的右旋糖酐被广泛应用于医药、食品及化工等领域中。重均分子量(Mw)为104Da～105Da的右旋糖酐可作为代血浆,具有扩增血容量、降低血液黏度及抗凝血等功能。小分子量右旋糖酐(Mw<104 Da)可作为高附加值的益生元,添加到保健品中。传统上,采用的“菌种发酵-酸水解-乙醇分级沉淀”制备特定分子量药用右旋糖酐的方法存在操作繁杂、产品质量较差且容易引发临床副反应等诸多可以改善的地方。酶法耦合两级膜制备右旋糖酐具有提高产物均一性、简化下游产物分离纯化等优点。本课题通过单酶法(右旋糖酐蔗糖酶)耦合两级膜探索右旋糖酐的聚合机理;双酶法(右旋糖酐蔗糖酶和右旋糖酐酶)耦合两级膜实现对特定分子量及分布的右旋糖酐的调控与定向制备。主要的研究内容和结果摘要如下:(1)建立HPGFC双柱串联法跟踪检测产物右旋糖酐分子量、定量检测蔗糖消耗量、葡萄糖和果糖量的变化。通过对比KS-801、KS-805单柱及双柱串联条件下对系列右旋糖酐标准品的分离效果,初步确定了 KS-801和KS-805双柱串联检测的有效性;此外,对比单柱及双柱条件下发酵产物的色谱图发现,双柱串联不仅能够实现对各个分子量片段右旋糖酐的检测,而且可以有效地分离、鉴定和定量检测发酵液中的蔗糖、葡萄糖和果糖。(2)探究了单酶法耦合两级膜条件下右旋糖酐蔗糖酶催化合成产物右旋糖酐的机理,并且研究了不同蔗糖底物浓度及右旋糖酐蔗糖酶添加量对产物右旋糖酐分子量、产量、得率及蔗糖转化率的影响。通过跟踪检测不同蔗糖浓度和右旋糖酐蔗糖酶添加量条件下,一级膜和二级膜料液桶中右旋糖酐分子量的变化,间接的证实了右旋糖酐的聚合机理有可能是右旋糖酐分子链在右旋糖酐蔗糖酶活性位点上不断聚合葡萄糖基,直至达到一定的分子量(Mw>106 Da)才脱落,而不是一个从小到大,慢慢聚合,不断脱落的过程。在两级膜的干预下,右旋糖酐分子量同蔗糖底物浓度和右旋糖酐蔗糖酶添加量呈正相关关系;蔗糖转化率反比于蔗糖底物浓度,正比于右旋糖酐蔗糖酶添加量;右旋糖酐产量正比于蔗糖底物浓度和右旋糖酐蔗糖酶添加量。(3)在单酶法耦合两级膜的基础上引入右旋糖酐酶构建双酶法耦合两级膜反应体系对右旋糖酐分子量进行调控。在双酶酶活比(右旋糖酐蔗糖酶:右旋糖酐酶)为10:1,底物浓度为0.8 M、右旋糖酐蔗糖酶添加量为0.2 U/mL时,二级膜料液桶中目标分子量片段右旋糖酐(104 Da<Mw<105 Da)所占比例达到68.71%。两级膜的作用使得二级膜料液桶中右旋糖酐分子量分布很集中,产物均一度(D值接近1)较高。另外,双酶法耦合两级膜制备右旋糖酐过程中0.6 U/mL反应体系系列的产物右旋糖酐分子量变化遵循超声降解右旋糖酐的经典“链中点剪切模型”:ln(M0-Mlim/Mt-Mlim)=kMlimt。经过拟合后,线性关系良好,此模型可较好的估计或预测任意反应时间内产物右旋糖酐的分子量水平。