研究背景：我国是肝炎大国,每年死于肝衰竭的患者约有40万人。肝衰竭的内科治疗效果较差,在原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)临床应用以前,肝衰竭的的存活率<20%。目前,国外文献报道经有效治疗的肝衰竭患者的存活率>65%。但国内肝衰竭患者的预后仍很不理想。OLT治疗肝衰竭的效果理想而肯定,是目前治疗急性肝衰竭、终末期肝病和代谢性肝病的主要方法。但由于供体短缺、免疫排斥及高额的手术治疗费用严重限制其应用于临床,许多患者在等待中死亡。目前治疗肝衰竭的新兴方法还有人工肝支持系统、肝细胞移植、异种器官移植等。其中肝细胞移植由于其众多的优点,已被认为是最具前景的AHF治疗方法之一。肝细胞移植相较于原位肝移植具有以下优点：①相对OLT巨大的手术创伤而言,对患者的创伤性损害较小,尤其是已经不能耐受手术的肝功能极差的患者,同时也可以避免OLT所引起的急性血管排斥反应；②操作方法简单,目前主要采用门静脉注入方式,其他还有脾内注射,大网膜种植等移植方法；③手术费用低,是全肝移植费用的5%-10%；④分离的肝细胞可以保存,所以可以是随时的、多次重复的用于肝衰竭病人的治疗；⑤分离一次可以用于多个肝衰竭患者的治疗,即一对多的治疗；⑥肝细胞移植可保证患者肝脏结构的完整性,急性肝衰竭患者的肝脏可渡过危险期,通过再生使其自身功能的恢复；⑦可对移植的肝细胞进行基因修饰。目前正在研究可供移植的肝细胞有多种,如异种肝细胞、人体干细胞和原代肝细胞移植。异种移植利用猪和狒狒等灵长类动物肝脏作为细胞来源,具有来源丰富,繁育方便,价格较低等优点。但异种移植带来的免疫排斥反应、生理生化兼容性及潜在的病原体传播的风险阻碍了其在临床中的应用。限于动物种系选择、病原体传播及伦理等方面,异种肝细胞移植较其他两种移植有较大的风险。干细胞具有自我更新和分化能力,分有胚胎肝细胞、胎儿干细胞和成人干细胞。源于胚胎和胎儿的干细胞受到政治法律和伦理道德的限制,即使具有功能良好和免疫排斥少等优势也未能大规模展开应用。研究证明人体肝脏祖细胞能修复受损肝脏并使肝脏再增殖,但移植后细胞难以跟踪证明是否能使肝脏完全再生。另有骨髓干细胞和脂肪间充质干细胞具有细胞融合和多向分化能力,成为细胞移植研究热点。肝细胞移植是由Bumgardner率先提出,而世界第一例人体肝细胞移植临床应用是Mito于1992年分离慢性肝病患者自身肝细胞并进行自体移植,证明人肝细胞有修复急性肝损伤的能力,可在一定条件下重建衰竭肝脏。同时有文献报道表明有急性肝衰竭患者接受人肝细胞移植,移植后血氨和胆红素水平降低,并且部分患者肝功能完全恢复。肝细胞移植作为新的治疗AHF手段前景诱人,但还需要克服的问题仍很多。如肝细胞移植后引发的免疫排斥反应就是一个重要问题,将移植肝细胞进行微囊包裹,或者从肝脏实质细胞中去除抗原递呈细胞可以降低肝细胞免疫源性,或者封闭抗原递呈细胞的T细胞共刺激分子(B7蛋白)也可以调控免疫源性,这些都是解决免疫问题的措施。如何解决免疫排斥反应是肝细胞移植应用的重点,但如何提供足够数量、功能良好肝细胞更是决定肝细胞移植能否广泛应用的关键。相比全肝移植,肝细胞易于保存和运输,若能解决肝细胞的来源问题,肝细胞移植将来可在临床上得到的广泛应用。研究目的：本实验通过向SD大鼠脾内注射移植永生化HepGL肝细胞,对急性肝衰竭的大鼠模型进行救治,研究永生化HepGL肝细胞在动物体内的功能,探讨其是否具有替代并重建衰竭肝脏的能力。同时为其将来作为生物人工肝的种子细胞的应用奠定理论基础。实验方法：1.SD大鼠急性肝衰竭(Acute Hepatic Failure, AHF)模型的建立；采用90%肝部分切除术建立SD大鼠AHF模型,具体步骤如下：(1)术前准备包括,术前SD大鼠禁食6h,改喂饮10%葡萄糖水；手术器械高压灭菌；药物(硫酸阿托品、乙醚、青霉素钠等),耗材(5-0丝线、纱布、棉球、棉签、一次性使用注射器等)等的准备；(2)术前准备完成后,将大鼠用乙醚麻醉,待大鼠麻醉后,将其固定于自制手术台上,肌注阿托品0.03mmg(配成0.5ml盐水溶液),并用50ml离心管内放入浸湿了的无水乙醚的棉球,将管口对准大鼠口鼻,持续吸入麻醉,麻醉深度的调节以大鼠停止躁动,呼吸平稳为准；(3)一切就绪后,备皮刀刮毛、腹部常规3次消毒、铺无菌洞巾；(4)选择腹部横切口入腹,以剪刀剪开皮肤、肌肉及腹膜各层,以自制拉钩充分暴露肝脏,解剖各肝叶间及与周围组织之间的菲薄韧带；(5)依次游离出各肝叶后,在右上叶(Right superior lobe,RSL)与肝中叶(Median lobe,ML)之间,游离出肝脏的Glisson系统头支主干,以5-0丝线穿过结扎,可见肝中叶(ML)、左外叶(Left lateral lobe,LLL)迅速缺血,待肝叶变为土黄色后,5-0丝线结扎相应肝叶的肝蒂后并切除；游离出右上叶(RSL)与右下叶(Right inferior lobe,RIL)的共同Glisson系统右支主干,5-0丝线结扎后同上依次切除右上叶与右下叶；仅保留包括前叶(Superior caudate lobe,SCL)与后叶(Inferior caudate lobe,ICL)的尾状叶(Caudate lobe,CL)及腔静脉旁部(paracaval liver,PL)(约占肝脏总量的10%)。检查腹腔内无出血后,于腹腔内注射青霉素20万单位溶液lml,依次缝合腹膜、肌层和皮肤,缝合皮肤前停止乙醚麻醉；(6)术后普通块料喂养,喂饮10%葡萄糖水,室温18～22℃,光照12h/d。2.永生化HepGL肝细胞移植；(1)实验分组：实验组(n=21)—脾内注射约2.5*107个永生化HepGL肝细胞(配成0.5mlDMEM混悬液)/只；空白组(n=21)—未做任何治疗的急性肝衰竭组；(2)实验组永生化HepGL肝细胞移植步骤：SD大鼠腹部行约1cm纵切口,用无菌棉签伸入胃下提出脾脏,2.5*107个永生化HepGL肝细胞(配成0.5mlDMEM混悬液)大鼠脾内注射,注射24h后SD大鼠行90%肝部分切除术。3.观察项目；(1)大体观察：观察空白组及实验组SD大鼠术后的饮食、精神状态、活动量及对外界刺激反应及相关的症状表现等情况。(2)存活率：记录大鼠的死亡时间。(3)生化检查：收集Oh、24h、72h、7d、14d大鼠的静脉血,检测肝功能指标包括：①谷丙转氨酶(ALT)、②总胆红素(Tbil)、③白蛋白(ALB)、④血氨(NH3)、⑤血糖(Glu)、⑥凝血时间(PT)等的变化。(4)病理组织检查：在24h、72h、7d、14d取大鼠肝脏及脾脏做组织病理切片及免疫组化,以了解大鼠肝脏急性肝衰竭病理变化、恢复情况以及移植的HepGL细胞在大鼠体内的存活的情况。实验结果：1.大体观察实验组与空白组SD大鼠均在术后3-10min内即可苏醒翻身爬起,空白组大鼠12h后出现急性肝衰竭症状,包括精神萎靡,拒饮食,对外界反应迟钝,全身蜷缩,鼠毛竖立,尿色发黄、腹泻,口鼻眼角出血等,大部分个体开始逐渐出现肝昏迷直至死亡。实验组大鼠12h后也有精神萎靡,食欲下降,对外界反应迟钝,全身蜷缩,鼠毛竖立等症状,但程度较轻,且无口鼻眼角出血等症状,也有部分个体出现肝昏迷并死亡,部分个体尸解可见腹腔内有较清澈的腹水。2.存活率观察两组术后7d存活率,实验组7d存活率66.67%(14/21),死亡时间点分别为15h、35h、41h、45h、60h、62h;空白组7d存活率为28.57%(6/21),死亡时间点分别为16h、21h、23h、26h、32h、35h、38h、38h、41h、42h、50h、54h、60h、63h、70h,两组死亡基本全部发生在3d内,大鼠存活超过3d,便可长期存活。3.生化检查两组大鼠术后各生化指标均有明显变化,两组ALT、Tbil、NH3、PT等四项指标均在术后24h上升到最高值,且四项指标两组之间均存在差异(P<0.05),后逐渐恢复；两组ALT、Tbil指标72h也存在明显差异(P<0.05),在7d、14d点基本持平；两组PT仅在24h有明显差异；两组ALB、Glu术后均出现下降,ALB指标空白组在7d出现最低值,而实验组在72h出现最低值,两组在24h、72h、7d各点均有明显差异(P<0.05); Glu指标两组均在24h出现最低值,在72h有明显差异(P<0.05)。4.病理组织检查空白组大鼠术后24h时见残余肝脏大体组织色泽淡黄,包膜肿胀,质地松软,触之易碎,镜下可见空泡变性和炎细胞浸润；72h时残余肝脏较前增大,边缘可见血管增生,镜下可见弥漫大量空泡变性和炎细胞浸润,肝小叶结构破坏。实验组大鼠注射后24h时,脾脏红肿,呈鲜红色,术后肝脏病理表现同空白组,脾脏可见表面有斑点状突起。免疫组化可见细胞在脾脏内成团聚集,在肝脏内主要停留在肝血管窦部。实验结论：实验组大鼠生存质量以及存活率明显优于空白组,两组生化指标在一定时间点存在明显差异,组织病理发现实验组大鼠体内存在移植的永生化HepGL肝细胞；说明永生化HepGL肝细胞在动物体内具备一定的生物学功能,能一定程度的替代部分肝功能,可作为生物人工肝的种子细胞研究使用。