琼胶酶是一种能够降解琼脂以形成琼脂糖寡糖的糖苷水解酶,根据琼胶酶水解糖苷键的不同,可以分为α-琼胶酶(EC 3.2.1.158)与β-琼胶酶(EC 3.2.1.81)两类。目前,野生菌株生产琼胶酶存在诸多问题,缺点包括产酶量低、易污染、生长慢等,不利于大规模工业化生产。基于以上问题,本课题将一段弧菌琼胶酶蛋白基因重组于表达载体pET30a(+)上,然后转入宿主大肠杆菌BL21体内,通过宿主大肠杆菌的快速繁殖来实现琼胶酶的大量生产。构建成功的工程菌不仅产酶量高而且具有不易被杂菌污染、生长快的优点,这样为琼胶酶在今后工业化大规模生产提供理论依据。1.在本研究中,首先我们利用基因合成的方法合成了已报道的弧菌琼胶酶的基因,通过分子生物学手段将合成的弧菌琼胶酶基因aga2插入原核表达载体pET30a(+)中,并转入感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)中,构建成pET30a(+)-aga2重组表达载体。2.对构建的重组子进行诱导表达,利用DNS法测定琼胶酶酶活,对诱导条件和表达的琼胶酶酶学性质进行探究。构建成功的重组表达载体pET30a(+)-aga2,在IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导后,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可知表达的琼胶酶分子量为51.5kD,通过DNS法测定酶活58.60 U/mL。通过对诱导条件研究,结果表明最佳IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)终浓度为0.7mmol/L,最佳诱导温度为30℃,最佳诱导时间为9h。3.酶理化性质实验结果表明该琼胶酶最适作用pH值为9.0,最适作用温度为45℃,Fe3+、NH4+、Mg2+、K+、Na+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Cu2+、Ag+对琼胶酶的活力没有显著影响,Ca2+对琼胶酶具有显著的激活作用,而Pb2+、Fe3+对琼胶酶的活性有显著抑制作用。4.酶的稳定性实验显示,90℃处理30min仍有一定的活性,对pH的适用范围也比较大。构建的重组表达载体pET30a(+)-aga2,不仅具有很好的工业化生产潜力,同时考虑到琼胶酶对琼脂水解作用而呈现肉眼可见的凹陷状,重组表达载体pET30a(+)-aga2可作为功能基因筛选的标记工具。