背景食管癌（Esophageal carcinoma,ESCA）是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一。在中国,食管癌最常见的病理类型是食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinomas,ESCC）。在早期阶段,ESCC对食管功能的影响通常很小,患者没有明显的症状。当出现临床症状时,大多数患者已经处于ESCC晚期,错过了手术治疗的机会。化疗是治疗晚期ESCC的主要方法,但是化疗的临床疗效有限,一线治疗患者的总生存期（overall survival,OS）仅5-10个月,复发、转移和耐药性仍然是ESCC患者死亡的主要原因。目前,靶向药物已经广泛应用于治疗多种恶性肿瘤,其治疗效果好且副作用较放化疗小,但是针对食管癌的靶向药物较少,且作用机制研究尚未完全阐明。阿帕替尼是血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2）的小分子酪氨酸激酶抑制剂。它具有高选择性,可竞争VEGFR2的ATP结合位点,阻断下游信号转导并抑制酪氨酸激酶的产生,从而抑制血管生成。已有多项研究表明VEGFR2与恶性肿瘤的发生、发展密切相关,阿帕替尼可通过抑制肿瘤的生长及转移,与化疗药物协同抗肿瘤作用来延长患者的生存期。研究表明,AKT/mTOR信号通路在癌症进展中起着重要作用,可以调节包括ESCC细胞在内的癌细胞生长和转移。研究证实阿帕替尼不仅抑制AKT/mTOR信号通路,促进肿瘤细胞的凋亡或自噬,还可以抑制癌细胞的侵袭、转移及上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程,来抑制癌症的进展。目前,关于阿帕替尼治疗ESCC的研究较少,主要集中在阿帕替尼竞争VEGFR2的ATP结合位点来抑制血管生成从而发挥抗肿瘤现象的研究,缺少阿帕替尼抑制食管癌发生、发展作用机制的研究。在本研究中,我们分析多个数据库中VEGFR2在食管癌及癌旁组织中的表达差异,及其与预后的关系。检测99例初治ESCC患者食管鳞癌组织及40例癌旁正常组织中VEGFR2的表达水平,并探讨了其临床意义。通过体外细胞实验探究了阿帕替尼对ESCC细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响,应用western blot技术检测阿帕替尼对凋亡、转移、EMT相关蛋白及AKT/mTOR通路关键蛋白的影响,分析其作用机制。通过体外实验进一步探讨了阿帕替尼联合细胞毒药物对ESCC增殖、迁移、侵袭的影响,应用Western blot技术检测阿帕替尼与细胞毒药物的协同作用对凋亡、转移、EMT相关蛋白表达的影响;建立ESCC裸鼠移植瘤模型,通过体内实验探索阿帕替尼联合细胞毒药物对肿瘤生长的影响,Tunel实验检测肿瘤组织中细胞凋亡率,免疫组织化学（IHC）方法检测Ki67蛋白在肿瘤组织中的表达。主要分以下四个部分:第一部分VEGFR2在人食管鳞癌及正常食管组织中的表达水平及其临床意义目的应用IHC方法检测ESCC患者肿瘤组织及癌旁正常组织中VEGFR2蛋白的表达水平,探讨VEGFR2异常表达的临床意义。方法1.应用GEPIA网站提供的公开数据库,分析VEGFR2基因在多种恶性肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达差异。分析食管癌组织及正常食管组织中VEGFR2基因的表达水平的差异,分析VEGFR2基因表达水平与食管癌患者临床分期及预后的关系。2.应用IHC方法检测99例ESCC患者肿瘤组织及40例癌旁正常组织中VEGFR2的表达水平。3.收集99例ESCC患者临床资料,分析VEGFR2表达水平与临床病理特点及预后的关系。结果1.来自GEPIA网站TCGA数据库的分析结果显示,VEGFR2基因在肾透明细胞癌（KIRC）的癌组织中的表达水平明显高于其在邻近正常组织中的表达水平,在子宫体子宫内膜癌（UCEC）的肿瘤组织中的表达水平明显低于其在邻近正常组织中的表达水平。VEGFR2基因在食管癌组织中的表达水平高于其在正常食管组织中的表达水平,但其差异在统计学上没有意义。VEGFR2基因表达水平与食管癌临床分期相关（P＜0.05）。分析生存数据发现VEGFR2基因高表达食管癌患者的OS低于VEGFR2基因低表达食管癌患者的OS（P＜0.05）。2.IHC方法检测VEGFR2在ESCC患者肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达水平显示,VEGFR2在食管鳞癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织（P＜0.0001）。3.分析VEGFR2蛋白表达水平与临床病理特点及预后的关系,结果显示VEGFR2的表达与浸润深度、不良分化水平及淋巴结转移呈正相关（P＜0.05）。VEGFR2蛋白高表达的ESCC患者较VEGFR2低表达的患者有较差总体生存期（P＜0.0001）。小结与癌旁正常组织相比,VEGFR2蛋白在食管癌组织中表达水平显著升高。VEGFR2蛋白表达水平与肿瘤浸润深度及淋巴结转移呈正相关,与分化水平及预后呈负相关。VEGFR2可作为ESCC治疗的潜在靶点。第二部分体外实验探讨阿帕替尼对食管鳞癌细胞的作用及机制目的通过体外细胞实验研究阿帕替尼对食管癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及EMT的影响,研究阿帕替尼对AKT/mTOR通路的影响。方法1.用CCK8检测阿帕替尼对食管鳞癌细胞增殖的影响。2.用Annexin V/PI法检测阿帕替尼对食管鳞癌细胞凋亡的影响。3.用划痕实验检测阿帕替尼对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。4.用Transwell法检测阿帕替尼对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响。5.用Western blot方法检测VEGFR2蛋白在食管鳞癌细胞中（KYSE450、EC1）的表达水平。检测阿帕替尼处理食管鳞癌细胞后,细胞中Bcl2、MMP9、E-cadherin 和 vimentin 蛋白以及 AKT/mTOR 通路中 AKT、p-AKT、S6 和 p-S6蛋白表达水平的变化。检测阿帕替尼联合AKT通路抑制剂或mTOR通路抑制剂处理食管鳞癌细胞后,细胞中AKT、p-AKT、S6和p-S6蛋白表达水平的变化。结果1.CCK8结果显示,阿帕替尼显著抑制了食管鳞癌细胞的细胞增殖能力（P＜0.001）,这种抑制能力具有时间及剂量依赖性;与EC1细胞相比,相同浓度的阿帕替尼对KYSE450细胞增殖的抑制作用更强。2.Annexin V/PI结果显示,阿帕替尼可促进食管鳞癌细胞的细胞凋亡（P＜0.001）。3.划痕实验结果显示,阿帕替尼可抑制食管鳞癌细胞的迁移能力（P＜0.001）。4.Transwell结果显示,阿帕替尼可抑制食管鳞癌细胞的侵袭能力（P＜0.001）。5.Western blot结果显示,VEGFR2蛋白在KYSE450细胞中的表达水平高于其在EC1细胞中的表达水平。在给予食管鳞癌细胞阿帕替尼处理后,细胞中Bcl2,MMP9和vimentin蛋白表达水平降低,E-cadherin蛋白表达水平升高,AKT/mTOR通路中p-AKT及p-S6蛋白表达水平降低。阿帕替尼联合AKT通路抑制剂处理食管鳞癌细胞后,联合处理组的细胞中p-AKT及p-S6蛋白表达水平比单药处理低。阿帕替尼联合mTOR通路抑制剂处理食管鳞癌细胞后,联合处理组的细胞中p-S6蛋白表达水平比单药处理低。小结1.阿帕替尼抑制食管癌细胞增殖、迁移及侵袭,促进细胞凋亡,对于VEGFR2高表达细胞的增殖具有更强的抑制作用;阿帕替尼抑制Bcl2、MMP9蛋白的表达水平,增加E-cadherin蛋白的表达水平。2.阿帕替尼抑制食管鳞癌细胞中AKT/mTOR通路活性。阿帕替尼可以通过抑制p-AKT及p-S6蛋白的表达,增强AKT/mTOR通路抑制剂对AKT/mTOR通路的抑制作用。第三部分体外实验探讨阿帕替尼增强细胞毒药物对食管鳞癌的抗肿瘤作用及机制目的通过体外细胞实验检测阿帕替尼联合细胞毒药物对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭及EMT的影响。方法1.用CCK8检测不同浓度细胞毒药物（5-氟尿嘧啶,紫杉醇,顺铂）在不同时间作用于食管鳞癌细胞系对细胞增殖情况的影响。接下来将实验分为8组:对照组、5-氟尿嘧啶组,紫杉醇组,顺铂组,阿帕替尼组,阿帕替尼+5-氟尿嘧啶组、阿帕替尼+紫杉醇组、阿帕替尼+顺铂组,用CCK8检测阿帕替尼与细胞毒药物联合应用对食管鳞癌细胞增殖情况的影响。2.用划痕实验检测阿帕替尼与细胞毒药物联合应用对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。3.用Transwell法检测阿帕替尼与细胞毒药物联合应用对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响。4.用Westernblot方法检测阿帕替尼联合细胞毒药物处理食管鳞癌细胞后,细胞中Bcl2,MMP9,E-cadherin和vimentin蛋白表达水平的变化。结果1.CCK8检测结果表明,随着浓度增加,时间延长,细胞毒性药物组ESCC细胞中的增殖速率低于对照组（P＜0.001）。阿帕替尼与细胞毒药物联合应用对食管鳞癌细胞增殖的抑制作用强于单药处理组（P＜0.001）。2.划痕实验结果显示,阿帕替尼与细胞毒药物联合应用对食管鳞癌细胞迁移的抑制作用强于单药处理组（P＜0.01）。3.Transwell结果显示,阿帕替尼与细胞毒药物联合应用对食管鳞癌细胞侵袭的抑制作用强于单药处理组（P＜0.05）。4.Western blot结果显示,与单药处理组相比,阿帕替尼联合细胞毒药物处理食管癌细胞后,细胞中Bcl2、MMP9、vimentin蛋白的表达水平明显降低,E-cadherin蛋白的表达水平明显升高。小结阿帕替尼可增强细胞毒药物对食管鳞癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用;与单药组相比,阿帕替尼与细胞毒药物联合用药组对Bcl2、MMP9、vimentin蛋白表达的抑制作用更强,对E-cadherin蛋白表达的增强作用更强。第四部分体内实验探讨阿帕替尼对食管鳞癌细胞的作用及增强细胞毒药物对食管鳞癌的抗肿瘤作用及机制目的构建裸鼠食管癌皮下移植瘤模型,检测阿帕替尼单药及联合细胞毒药物对食管肿瘤重量和体积的影响,以及对肿瘤凋亡、增殖的影响。方法1.应用食管鳞癌细胞建立食管癌裸鼠移植瘤模型,将所有裸鼠随机分为8组:对照组、5-氟尿嘧啶组,紫杉醇组,顺铂组,阿帕替尼组,阿帕替尼+5-氟尿嘧啶组、阿帕替尼+紫杉醇组、阿帕替尼+顺铂组。定期观察和测量各组小鼠的体重状态,移植瘤的体积等。取出食管鳞癌移植瘤,并称量移植瘤的重量。2.Tunel检测肿瘤的细胞凋亡情况。3.免疫组织化学检测肿瘤Ki67蛋白的表达水平。结果1.裸鼠实验结果显示,阿帕替尼抑制小鼠食管癌肿瘤体积的增长,与单药组相比,阿帕替尼联合细胞毒药物治疗组移植瘤的体积及重量明显较小（P＜0.05）,阿帕替尼+顺铂组效果最显著。2.Tunel实验结果显示,阿帕替尼促进小鼠食管癌肿瘤组织的细胞凋亡,与单药组相比,阿帕替尼联合细胞毒药物治疗组凋亡的细胞明显较多。3.免疫组织化学结果显示,阿帕替尼处理的实验组裸鼠其肿瘤组织中Ki67蛋白的表达降低,与单药组相比,阿帕替尼联合细胞毒药物治疗组的Ki67蛋白表达水平显著降低。小结1.阿帕替尼可以抑制食管鳞癌移植瘤裸鼠模型中肿瘤的生长,且增强细胞毒药物的抗肿瘤活性,在所有实验组中,阿帕替尼联合顺铂的抗肿瘤作用最佳。2.阿帕替尼及细胞毒药物可以促进肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,两者联合应用时具有协同抗食管鳞癌作用。