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第一部分TOLL样受体4在脂多糖诱导的小鼠急性肾功能衰竭中的表达及意义论文1:TLR4与小鼠内毒素型急性肾功能衰竭的相关性研究目的研究TOLL样受体4(TOLL like receptor 4 ,TLR4)与内毒素诱导的小鼠急性肾功能衰竭(ARF)的相关性关系。方法建立脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)15mg/kg单次腹腔注射诱导雄性C57BL/6小鼠内毒素性急性肾功能衰竭模型。分别于注射后第12h、24h、36h、48h的时间点采集血液及组织标本。检测血肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及用Nomura评分法对肾组织病理改变进行半定量评分。应用免疫组织化学SABC法对正常对照组(NG)及急性肾功能衰竭(ARF)组小鼠肾组织标本中的TLR4进行定位及半定量分析;Western blot检测两组肾组织总TLR4蛋白的改变;RT-PCR检测各组小鼠肾组织总TLR4 mRNA的表达变化。TUNEL法检测两组肾组织中凋亡小体情况。结果注射LPS后模型组BUN、Cr逐渐上升,24h达高峰(BUN 28.14±2.55mmol/L,Cr 207.73±12.1μmol/L),约48h后逐渐恢复正常;与NG组相比,ARF组的TLR4蛋白及mRNA水平的表达显著上调,以造模24h时最明显;TUNEL法结果显示凋亡小体主要出现在ARF组肾脏的近端小管及管周围,肾小球无明显变化。TLR4蛋白的光密度值与Cr、BUN值的相关系数分别为0.907、0.926;与肾组织凋亡的光密度值的相关系数为0.954;肾组织凋亡的光密度值与Cr、BUN值的相关系数分别为0.932、0.951。结论TLR4、肾组织凋亡均与小鼠内毒素型ARF的肾功能改变呈正相关关系,同时TLR4与肾组织凋亡也呈正相关关系,TLR4可能通过促进肾组织细胞凋亡参与ARF的发生。论文2:应用基因缺失小鼠研究TOLL样受体4在脂多糖诱导的急性肾功能衰竭中的作用目的进一步明确TOLL样受体4(TLR4)在脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肾功能衰竭(ARF)肾脏中的作用机制。方法:以TLR4基因缺失的C3H/HeJ小鼠和其野生正常对照的C3H/HeN小鼠为实验对象。实验分TLR4+(C3H/HeN)组、TLR4-(C3H/HeJ)组小鼠,单次性腹腔注射LPS(15mg/kg)诱导小鼠ARF模型。24h后检测血清肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)值来评估肾功能;Nomura评分法对肾组织病理改变进行半定量评分;免疫组织化学SABC法检测TLR4在两组小鼠肾组织中的表达、RT-PCR法检测肾组织总TLR4 mRNA的表达变化、免疫蛋白印迹检测肾组织总TLR4蛋白水平;TUNEL法检测肾脏组织的凋亡情况。结果:TLR4(+C3H/HeN)组的Cr、BUN分别为202.26±11.08umol/L、20.36±1.52mmol/L,TLR4-(C3H/HeJ)组的Cr、BUN分别为109.67±13.32umol/L、6.42±0.41mmol/L,差异有显著性(P<0.01);TLR4-(C3H/HeJ)组的肾组织结构正常,无明显的病理改变,而TLR4+(C3H/HeN)组小鼠肾小管呈轻中度的病理改变,主要表现为近端肾小管管腔扩大、空泡形成等;与TLR4-(C3H/HeJ)组相比,TLR4+(C3H/HeN)组的TLR4蛋白及mRNA表达明显上调;TUNEL法显示凋亡小体主要出现在TLR4+(C3H/HeN)组小鼠肾脏的近端小管及管周围,肾小球无明显凋亡小体出现,TLR4-(C3H/HeJ)组小鼠肾组织中未检测到凋亡小体,二者平均光密度值差异有显著性(0.117±0.008 vs 0.038±0.003,P<0.001)。结论:TLR4在LPS诱导的小鼠急性肾功能衰竭的发病中重要作用。LPS可能通过激活TLR4信号转导途径引起肾组织中肾小管上皮细胞凋亡过度,肾小管上皮细胞数量减少,从而导致急性肾功能衰竭的发生。第二部分脂多糖刺激下人肾小管上皮细胞TLR4的表达研究论文1:LPS促进人近端肾小管上皮细胞TLR4的表达目的研究人近端肾小管上皮细胞(HKC)在脂多糖(LPS)刺激下Toll样受体4(TLR4)的表达及作用。方法实验细胞分两组,LPS刺激组(50ng/ml LPS加入体外培养的HKC)和正常对照组;应用免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察LPS刺激24小时后TLR4在HKC中的分布及表达强弱;半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测各组TLR4及内参照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表达量;Annexin V-FITC结合流式细胞仪检测各组细胞的早期凋亡率情况。结果LPS刺激组TLR4的免疫荧光强度显著高于正常对照组,TLR4主要分布于HKC的胞膜及胞浆区;刺激组TLR4 mRNA表达高于正常对照组(1.051±0.082 vs 0.38±0.036),差异有显著性(P<0.01);刺激组TLR4蛋白表达高于正常对照组(0.371±0.033 vs 0.105±0.008),差异有显著性(P<0.01);LPS刺激组细胞的早期凋亡率(41.29%)显著高于正常对照组(2.36%)结论LPS能刺激HKC高表达TLR4 ,且促进HKC的早期凋亡,TLR4可能在LPS诱导的HKC凋亡中发挥一定的作用。第三部分特异性shRNA对HEK 293细胞和人肾小管上皮细胞TLR4表达抑制的作用研究论文1:特异性shRNA抑制HEK 293细胞TOLL样受体4的表达目的研究RNA干扰法对人胚肾细胞(HEK 293)中Toll样受体4(TLR4)表达的抑制作用。方法采用体外转录的方法生物合成针对TLR4分子设计的特异性短发卡RNA(shRNA)双链分子,用脂质体转染的方法导入体外培养的HEK293细胞;实验细胞分三组:干扰组(将针对TLR4的特异性shRNA转染正常HEK293细胞),阴性对照组(将非特异性的阴性对照的shRNA转染正常HEK293细胞)及正常组(无转染);流式细胞仪检测shRNA分子的转染效率;应用免疫荧光染色在共聚焦显微镜下观察TLR4的分布及表达强弱;半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测TLR4及内参照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表达量。结果特异性的针对TLR4的shRNA双链分子在HEK293细胞的转染率达82.47%;干扰组TLR4的免疫荧光强度显著低于阴性对照组及正常组细胞,TLR4主要分布于HEK293细胞的胞膜及胞浆区。干扰组细胞的TLR4 mRNA的光密度比值显著低于阴性对照组及正常组(0.35±0.003 vs 0.98±0.061 vs 0.955±0.058);干扰组细胞的TLR4蛋白的光密度比值显著低于阴性对照组及正常组(0.089±0.007 vs 0.153±0.011 vs 0.142±0.001);结论采用生物体外转录的方法成功合成针对TLR4的shRNA双链分子,并有效地转入HEK293细胞中使TLR4的表达下调。论文2:特异性shRNA抑制LPS刺激下TLR4对人肾小管上皮细胞的促凋亡作用目的研究体外转录生物合成的shRNA对人肾小管上皮细胞(HKC)中Toll样受体4(TLR4)表达及TLR4对HKC细胞促凋亡的抑制作用。方法用体外转录的方法生物合成针对TLR4分子的特异性短发卡RNA(shRNA)双链分子,用脂质体转染的方法导入在脂多糖(LPS)刺激下的体外培养的HKC;实验细胞分四组:LPS组(在培养的HKC中加入50ng/ml的LPS)、LPS+干扰组(在培养的HKC中加入50ng/ml的LPS的同时转染针对TLR4的特异性shRNA双链分子)、LPS+阴性对照组(在培养的HKC中加入50ng/ml的LPS的同时转染非特异性的阴性对照的shRNA双链分子)、正常组(不加LPS,也无转染shRNA);应用免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观测TLR4的分布及表达强弱;半定量RT-PCR和免疫蛋白印迹检测TLR4及内参照β-actin在mRNA水平和蛋白水平的表达量;Annexin V-FITC结合流式细胞仪检测各组细胞的早期凋亡率情况。结果LPS+干扰组细胞中TLR4的免疫荧光强度明显低于LPS组和LPS+阴性对照组,与正常组的TLR4免疫荧光强度相当;LPS+干扰组细胞的TLR4 mRNA的光密度比值(0.198±0.041)明显低于LPS组(0.445±0.049)和LPS+阴性对照组(0.438±0.052),与正常组无明显差异(0.152±0.038);LPS+干扰组细胞的TLR4蛋白的光密度比值(0.13±0.028)低于LPS组(0.307±0.035)和LPS+阴性对照组(0.283±0.032),与正常组无明显差异(0.098±0.018);LPS+干扰组细胞的早期凋亡率(8.89%)低于LPS组(43.57%)和LPS+阴性对照组(42.71%),与正常组细胞的早期凋亡率(3.51%)相当。结论采用生物体外转录的方法成功合成针对TLR4的shRNA双链分子,并有效地转入HKC细胞中使TLR4的表达下调,同时使LPS刺激下的HKC细胞的凋亡率下降,抑制TLR4的促细胞凋亡作用。