论文部分内容阅读
目的：目前，Rh(D)抗原在红细胞膜的表达机制仍不清楚，研究发现其表达可能依赖于一个复合体。其中，RHD基因存在多种不同的另路剪接转录子，它们很可能参与了D抗原的表达。本实验分别构建RHD基因几种不同转录子的真核重组表达载体，其中包括正常RHDcDNA，以及和正常RhD mRNA序列最相近的DEL9、DEL89转录子，期望为探讨Rh(D)抗原表达机制及复合体组成成分奠定相关基础。方法：收集Rh(D)阳性新生儿脐血，利用血清学及分子生物学方法分别鉴定其Rh表型和基因型：盐水试管法鉴定其Rh表型，包括Rh D、C、c、E和e抗原；RHD基因型的鉴定则通过提取样本DNA，用检测部分D型的试剂盒对RHD基因10个外显子进行检测，以确认其实属于包含所有10个外显子的Rh(D)阳性样本。利用全血总RNA提取试剂盒从此脐血网织红细胞中提取总RNA，根据设计的不同引物，分别采用一步法和两步法进行RT-PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳分离目的基因片段，再切胶并溶胶纯化目的基因；将纯化后的基因片段连接至TOPO TA克隆测序载体pCR4-TOPO，通过转化至TOP10大肠杆菌、以适量菌液均匀涂布至含氨苄青霉素的普通琼脂平板，37℃倒置过夜培养，其后，随机挑取单一菌落至含氨苄青霉素的液体培养基中37℃水平震摇过夜增菌筛选培养，随后以碱裂解法提取纯化质粒，再对提取的质粒进行测序，挑选出序列完整无突变的质粒；以该筛选质粒为模板，使用设计的新引物进行PCR，扩增为构建表达载体用的目的基因，经琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化，再将其连接至真核表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO，通过再次转化至大肠杆菌、筛选增菌培养，提取并纯化质粒，最后经质粒测序筛选出含有序列正确、无突变目的基因，且插入方向正确的重组质粒。结果：血清学盐水试管法初步检测结果显示2份样本均为Rh(D)阳性，Rh表型分别为DCcEe和DCCee；基因分型结果再次验证两样本均为Rh(D)阳性样本：没有发生外显子缺失。其后，成功提取样本总RNA，一步法RT-PCR扩增共获得五个转录子条带，分别为正常RHDcDNA，DEL9，DEL89，DEL79及DEL789。由于目的条带较弱，随后采用两步法RT-PCR获得正常RHDcDNA条带，紫外灯下切胶后溶胶纯化，而DEL9和DEL89转录子则直接合成。含上下游非编码区的RHDcDNA成功克隆至TOPO TA克隆测序载体，经过克隆筛选、质粒序列分析结果显示：获得的片段中含有正常无突变RHD基因编码区序列（包含基因上下游非编码区的序列），以此含RHDcDNA的筛选质粒为模板，经PCR扩增获得从起始密码子至终止密码子的RHD基因编码区全长序列（不含上下游非编码区）。之后将大量扩增后获得的RHDcDNA、以及DEL9和DEL89分别成功克隆至pcDNA3.1/V5-His-TOPO真核表达载体，经过筛选克隆、测序验证，三种目的基因片段序列完整无突变且插入方向均正确，从而成功构建3种不同RHD转录子的真核表达载体。结论：实验成功构建了正常RHDcDNA、以及DEL9和DEL89转录子的真核表达载体。RHD基因不同转录子表达载体的构建为进一步研究Rh(D)抗原的膜表达机理奠定了基础。DEL9及DEL89转录子的表达载体构建为进一步研究D放散型（Del）个体红细胞Rh(D)膜抗原表达机理奠定了基础。