研究背景子痫前期(Preeclampsia, PE)是妊娠期特有的一种多系统功能紊乱并血压、尿蛋白水平升高、水肿为主要临床特征的疾病,是导致孕产妇及围产儿死亡率升高的主要原因之一。根据血压和蛋白尿等程度,子痫前期可为轻度子痫前期和重度子痫前期,特别是重度子痫前期,严重威胁母儿健康。目前子痫前期确切病因和发病机制尚不明确,认为PE不是单一病因的疾病,可能是多种因素相互作用的结果。滋养细胞分化异常导致螺旋动脉重铸失败和胎盘浅着床、血管内皮细胞损伤、过度的炎性反应是PE的特征性病理生理变化,在PE发生发展的不同阶段发挥重要的作用。胎盘形成缺陷被认为是子痫前期的源头,胎盘是介于母体和胎儿的一个重要的中介性器官,胚胎依靠滋养层细胞对子宫基质和血管进行侵入,最终形成胎盘血液供应,以保证胚胎正常发育。子痫前期滋养细胞侵蚀能力低下的原因目前仍不清楚,免疫因素和氧化应激等因素均可导致滋养细胞增殖、凋亡、分化和入侵异常,通过对胎盘/滋养层生物学的研究对了解引起子痫前期病理生理机制是必要的。端粒酶(Telomerase)是一种核糖核蛋白,通过引物特异识别位点,以自身RNA为模板,在染色体末端合成端粒DNA,使端粒得以延长,为后续DNA聚合酶合成完整的染色体提供了平台,抵消或延缓端粒随细胞分裂的不断缩短,从而延长细胞的寿命甚至使其永生化。端粒在自身人端粒酶逆转录酶(Human Telomerase Reverse Transcriptase, hTERT)的催化下,抵消或延缓随细胞分裂而进行性缩短的端粒,因此其在细胞增殖和凋亡中起重要作用。滋养层有迅速增殖和入侵子宫壁的独特能力,这个能力赋予胎盘与肿瘤相似的特点。妊娠早期胎盘端粒酶活性较高,随着妊娠的进展端粒酶活性下调,这种端粒酶活性调节可能在正常妊娠胎盘衰老过程中起重要作用,可能与胎盘凋亡相关。端粒酶的表达与绒毛滋养细胞增殖和凋亡密切相关,可能是子痫前期胎盘滋养细胞侵入异常的原因。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)主要通过对内皮细胞的直接丝裂原作用而促进血管生成,体内bFGF可诱导血管内皮细胞增生、迁移。在妊娠早、中、晚期,bFGF在胎盘滋养层组织上的表达强度呈逐渐减弱,bFGF可能与滋养层增生、分化、迁移的相关,可能与子痫前期胎盘滋养细胞侵入异常的原因。二、研究目的通过观察子痫前期胎盘病理组织学改变,探讨子痫前期胎盘缺血缺氧的病理基础。通过检测足月子痫前期患者与正常足月妊娠,以及早产重度子痫前期与早产对照组之间胎盘组织hTERT、bFGF蛋白及hTERT mRNA的表达水平,了解子痫前期胎盘及正常妊娠对照组胎盘组织hTERT、bFGF蛋白及mRNA的达水平及差异,探讨妊娠期胎盘hTERT及bFGF的表达水平与子痫前期发病的关系。三、材料与方法1、材料来源：选取深圳市妇幼保健院产科住院孕妇总共72例,按照《妇产科学》第7版子痫前期的诊断标准选取例足月子痫前期孕妇29例为研究组,其中包括重度子痫前期16例为研究组A1,轻度子痫前期13例为研究组A2,选择无合并症足月妊娠孕妇的16例为其对照组A,选取早产重度子痫前期14例为研究组B,选取相应孕周无合并症早产孕妇13例,作为早产重度子痫前期的对照组B,各组孕妇之间年龄、孕周、孕产次均无统计学差异(P>0.05)。2、实验方法(1)胎盘病理学研究：胎盘娩出后,于胎盘母体面随机切取2块大小约为1.Ocm×1.Ocm×1.Ocm的组织块,于10%福尔马林液(Formalin)固定24-48小时,石蜡包埋,取4um厚连续切片,供胎盘病理组织学观察,每张切片在40倍物镜下观察胎盘病理学改变,观察合体细胞结节增多、细胞滋养细胞增生、纤维素样坏死及绒毛血管减少或淤血等情况。(2)免疫组化：胎盘娩出后,于胎盘中央带(脐带附着部的对侧母体面)切取2块大小约为1.0cmx1.0cmx1.0cm,避开钙化、坏死部位,如胎盘形态学研究制作方法制作蜡块及切片,采用SP法检测胎盘hTERT及bFGF蛋白的表达,最后显微镜下观察hTERT和bFGF免疫组化反应的定位、分布、及染色强度,采用灰度分析法,运用IPP6.0高清晰度彩色医学图文分析系统对切片上的染色信号进行灰度分析。阳性细胞表现为细胞胞浆和(或)基质有明显棕黄色颗粒沉着,染色明显高于背景。无着色或与背景颜色一致的为阴性细胞。在400倍的光镜下,每张切片随机选取5个视野,分析各视野阳性细胞的灰度值,灰度是指黑白图像中点的颜色深度,范围一般从0到255,白色为255,黑色为0,灰度值越大,着色越浅,所以,此处以平均背景灰度值-测得图片灰度值的差值的标准差(x士s)表示信号强度,反映hTERT及bFGF蛋白相对表达量,差值越大,染色越深。(3)实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Realtime-PCR, RT-PCR):于胎盘中央带(脐带附着部的对侧母体面),立即取胎盘的1.0cmx1.0cmxl.0cm大小数块,注意避开出血、梗死及钙化区。胎盘组织在生理盐水中漂洗干净,除去血液,于干纱布吸取表面水分,取约500mg装入RNA酶灭活的EP管中放入液氮灭活后于-80℃冰箱保存,按照说明书使用TRIZOL试剂无菌提取胎盘标本中的RNA,采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Realtime-PCR)检测胎盘中hTERT mRNA在转录水平的表达。按照下列公式计算样本中hTERT mRNA的相对表达量：△CT(目的基因)=目的基因CT-内对照基因CT,△△CT=△CT(目的基因)-△CT(标准值),目的基因的相对总量为2-△△CT。以正常足月胎盘组织hTERT mRNA的表达量作为标准,在此基础上比较足月子痫前期与足月正常对照组及早产重度子痫前期组与早产对照组胎盘hTERT mRNA的相对表达量。(4)统计方法：采用SPSS13.0统计软件包处理数据,免疫组化的结果的所有数据用均数士标准差(x士s)表示,多组均数比较采用方差分析和多重比较,两样本均数比较采用独立样本的t检验,检验水准为α=0.05。RT-PCR结果通过SPSS13.0软件进行协方差统计学分析,以α=0.05为显著检验水准,P<0.05具有统计学意义。四、结果1、胎盘病理学研究结果：正常足月胎盘绒毛中滋养细胞以合体滋养细胞为主,细胞滋养细胞及合体细胞结节比较少见,而早产胎盘有较多合体细胞结节,轻度子痫前期与正常足月胎盘病理改变相似；重度子痫前期组胎盘绒毛合体滋养结节显著增多；细胞滋养细胞增生显著；绒毛血管减少、淤血增加；绒毛间质纤维素样坏死增多。2、免疫组化hTERT及bFGF在胎盘组织中的表达：hTERT主要分布于滋养细胞的胞浆,少量分布于毛细血管血管内皮细胞胞浆中；bFGF主要分布于滋养细胞的胞浆、胞核,毛细血管血管内皮细胞胞浆中也有表达。hTERT在足月重度子痫前期组胎盘滋养细胞的表达(44.87±7.78)显著于低于相应孕周轻度子痫前期(52.87±7.16)及足月组(52.00±5.32),差异有统计学意义(P<0.05),早产组中胎盘滋养细胞的表达(63.78±12.20)较早产重度子痫前期组(47.69±12.82)明显增加,而足月轻度子痫前期与足月正常对照组差异无统计学意义(P>0.05),bFGF在早产重度子痫前期表达(74.36±12.32)高于早产组(55.32±19.99),差异有统计学意义(P<0.05),而足月轻度子痫前期组、重度子痫组与足月正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。3、RT-PCR法hTERT mRNA的表达：hTERT mRNA在足月子痫前期中的表达量1.49明显高于正常妊娠1.0(P<0.05),且足月重度子痫前期hTERT mRNA的表达量1.64较轻度子痫前期1.33明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。早产重度子痫前期胎盘hTERT mRNA的表达量1.74明显高于早产组中胎盘表达量0.88,差异亦有统计学意义(P<0.05)。五、结论1、重度子痫前期组胎盘病理组织学改变是胎盘绒毛对胎盘缺血、缺氧一种呈代偿性的增生反应。2、重度子痫前期胎盘hTERT蛋白表达低于对照组,推测子痫前期胎盘hTERT蛋白表达降低可能与子痫前期胎盘滋养细胞侵入异常有关,可能是引起滋养细胞浸润不足的原因。3、在足月轻度子痫前期组、重度子痫组与足月正常组胎盘组织bFGF的表达无差异,推测bFGF可能在足月胎盘不起作用；早产重度子痫前期胎盘表达较高,推测其可能起着调节滋养层增生、分化、迁移的作用。4、子痫前期胎盘hTERT mRNA表达增加,高水平的hTERT mRNA可能是胎盘凋亡诱导的端粒酶反应。