背景：胃癌是一种常见的恶性肿瘤,在我国胃癌的发病率居第二位,但死亡率则位居第一,严重危害人类健康。以往认为胃癌的发生是基因遗传学改变的结果。然而,近年来,越来越多的研究表明,表观遗传学改变在肿瘤的发生过程中起了关键的作用。DNA甲基化是目前研究较多的表观遗传机制,在胃癌的发生、发展中起重要作用。现已证实DNA甲基化是基因突变及缺失之外抑癌基因失活的第3种机制,而且在某些情况下是其失活的唯一机制。胃癌发生过程中,有许多抑癌基因因发生高甲基化而失活,导致胃癌的发生。CDKN2A(P16)是已经确认的抑癌基因,该基因的失活在肿瘤细胞增生过程中起着重要作用。P16基因的失活与胃癌、卵巢癌、肺癌等多种肿瘤发生密切相关。在胃癌中已被证实P16基因启动子区域异常甲基化是其失活的主要机制。基因甲基化可以抑制基因表达,但又是一种可逆的表观遗传学改变。目前,针对抑癌基因甲基化进行有效治疗是肿瘤研究的一个热点。去甲基化剂5-azacytidine和5-Aza-CdR均可使因甲基化而表达受抑制的抑癌基因重新表达,从而抑制肿瘤细胞生长。但是由于这两种药物缺乏特异性阻断效应,这限制了其应用范围,目前只用于骨髓增生异常综合症的治疗,尚未用于胃癌等实体瘤的治疗。探索特异性去甲基化药物,对于肿瘤的治疗有重要的意义。中医药治疗胃肠道肿瘤早有报道,探讨中医药对胃肠道肿瘤的作用机理,有望为胃癌的治疗提供新的药物以及治疗思路。关于中医药的研究甚多,但目前仅有极少几篇文献报道中医药影响基因甲基化的研究。魏品康教授提出了肿瘤的“痰污染学说”,在此学说的指导下,创立经验方消痰散结方,临床治疗胃癌效果明显。本课题拟从表观遗传学角度着手,初步探索消痰散结方对胃癌中P16基因甲基化的影响,以便阐明消痰散结方的作用机理；同时,为研究中医药与基因甲基化的关系提供理论基础。目的通过体外用含药血清干预胃癌细胞系,体内用消痰散结方煎剂给裸鼠人胃癌原位移植瘤模型灌胃,探讨消痰散结方对胃癌细胞系以及裸鼠原位移植瘤模型基因甲基化的影响；运用CCK-8法、RT-PCR；Methylight分子生物学方法,由定性到定量研究消痰方对肿瘤细胞系以及肿瘤组织中抑癌基因P16 mRNA表达以及DNA甲基化水平的影响,从表观遗传学角度探讨消痰散结方抗肿瘤的作用机理。方法1、6周龄SD雄性大鼠10只,体重350g±20g,随机分成空白对照组(生理盐水)、消痰散结方组(消痰散结方水煎剂),灌胃给药5日后股动脉取血制备药物血清。2、人胃癌细胞系MKN45, BGC823随机分成4组,1)药物血清组,每孔加入消痰散结方药物血清20μl; 2) 5-Aza-CdR组：每孔加5-Aza-CdR 20μl,药物浓度为5μmol/L; 3)空白血清组,每孔加入无药血清20μl；4)空白对照组,不加任何药物。每组设5个复孔,置37,5%CO2培养箱中培养24h、48h、72h后,每孔加入CCK-810μl,检测细胞活力3、分别收集药物作用前和药物作用72小时后的细胞,提取总RNA,紫外分光光度仪测纯度和浓度,RT-PCR测定P16基因mRNA表达；4、收集药物作用前后的细胞,用DNA Mini kit试剂盒抽提细胞DNA, Methylight法测定P16基因甲基化改变；5、培养人胃腺癌MKN-45细胞株,裸鼠腋窝皮下注射反复传代形成实体瘤,取第6代瘤块,造胃癌肿瘤原位移植模型；裸鼠原位移植瘤模型随机分成空白对照组、消痰散结方组,每组10只。于造模成功后72小时开始给药：消痰散结方组给予消痰散结方水煎剂(含生药量2.5lg/ml),空白对照组给予生理盐水。每次灌胃0.2ml,每日2次,连续给药6周,每周灌6天休息1天,给药期间观察裸鼠活动状况和瘤体生长状况,给药最后一天脱颈处死；6、第6周实验结束时取两组动物肿瘤组织称取瘤体重量,测定消痰散结方抑瘤率；7、第6周实验结束时取两组动物的肿瘤组织,提取总RNA,紫外分光光度仪测总RNA纯度和浓度,RT-PCR测定P16基因mRNA表达；8、第6周实验结束时,取两组动物的肿瘤组织；提取DNA, Methylight法测定P16基因甲基化改变。结果1、血清状况：实验动物生长良好,两组动物血液分别制备取得20ml无菌药物血清；2、抑瘤率：含药血清和5-Aza-CdR均可抑制胃癌细胞株MKN-45及BGC823细胞增殖,与空白对照组有明显差异(P<0.05),药物血清组抑瘤率高于5-Aza-CdR组。含药血清作用72小时后抑瘤作用最强,细胞生长最低降低为76.14%；空白血清组和空白对照组相比较则无明显差别(P>0.05)；3、RT-PCR结果显示：胃癌细胞系MKN45、BGC823中P16基因弱表达,通过含药血清以及5-Aza-CdR作用72小时后,P16基因表达明显升高。5-Aza-CdR组P16基因表达量高于中药药物血清组；4、Methylight测定P16基因甲基化水平：结果表明胃癌细胞系MKN45、BGC823中P16基因启动子明显甲基化(PMR>4),经过含药血清以及5-Aza-CdR作用72小时后,P16基因甲基化水平均明显降低,与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。5-Aza-CdR组P16基因甲基化水平明显低于药物血清组(P<0.05)。在MKN45细胞中,经5-Aza-CdR作用72小时后,无P16基因甲基化条带扩增；5、动物生长状况：实验过程中,术后第4天空白对照组动物死亡1只,经解剖发现肠粘连梗阻造成。各组标本数分别为空白对照组9只,消痰散结方组10只。在给药3周左右空白对照组开始出现活动减少、饮食减少,消瘦等现象；而消痰散结方组则在4周左右才出现类似情况。空白对照组在造模2周左右在上腹部触及肿块,而消痰散结方组则较晚。给药6周后,空白对照组出现消瘦,呈弓背,肋骨隐约可见,活动受限遂结束饲养,断颈处死动物；6、消痰散结方对原位移植瘤的影响：肿瘤呈实质性圆形或椭圆形,切面呈鱼肉状,表面结节状突起,较大者切开中央有小片浆液样坏死区。瘤体称量结果显示消痰散结方组的抑瘤率为54.82%,与空白对照组相比有统计学意义(P<0.01)；7、RT-PCR结果显示：裸鼠人胃癌原位移植瘤模型中P16基因弱表达,通过消痰散结方灌胃6周后,P16基因表达明显升高,与空白对照组比较有明显差异(P<0.01)；8、Methylight测定P16基因甲基化水平：裸鼠人胃癌原位移植瘤模型中P16基因启动子明显甲基化(PMR>4),通过消痰散结方灌胃6周后,P16基因甲基化水平均明显降低,与空白对照组比较有统计学差异(P<0.01)结论1、消痰散结方含药血清能抑制胃癌肿瘤细胞系的增殖；2、消痰散结方可抑制裸鼠人胃癌原位移植瘤模型肿瘤的生长；3、体外及体内实验显示消痰散结方能降低P16基因启动子区域甲基化水平,增加P16基因mRNA的表达；从而达到抑制肿瘤增殖的作用。