动脉粥样硬化是一种多因素共同作用的慢性血管炎症性疾病过程,脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础,病变发生时,脂质在炎症受损的血管内皮下沉积,伴随炎症细胞的浸润于沉积,逐步形成动脉粥样硬化斑块,一旦斑块破裂,斑块内容物释放与循环血中的白细胞和血小板互相黏连形成动脉血栓复合物,血栓会引起血管腔狭窄或堵塞,导致心肌梗死、冠心病、缺血性中风等恶性临床事件,是人类致死致残的常见病因。动脉粥样硬化是心血管疾病高发病率的主要原因,而心血管疾病已成为我国居民疾病的头号死因。因此,深入透彻研究动脉粥样硬化的发病过程和分子机制,加强动脉粥样硬化的预防和治疗,将有利于降低心血管疾病的疾病发病率,进一步改善和提高我国人民的身体健康和生活质量。正常情况下,覆盖于血管腔的内皮细胞感受来自于血流的物理、化学和生物的刺激,并对这些刺激做出反应,以保护血管的完整性,维持血管稳态。当血管发生血液扰动流时内皮细胞发生表型改变,表现为通透性增加,细胞因子释放和白细胞粘附,血管壁内皮细胞这些结构和功能变化,大大增加了对动脉粥样硬化的易感性。然而,迄今为止血液扰动流导致血管功能变化的分子机制还不十分清楚。旗语家族semaphorins最早被发现是调控神经生长的导向分子,然而近来的研究表明参与多种生理病理功能。我们继报道了Sema4D参与动脉粥样硬化后,最近又发现该家族的另一成员Sema7A的敲除可显著延缓动脉粥样硬化斑块的形成,尤其对血液扰动流出现的主动脉弓部调控作用尤为明显。然而,Sema7A参与动脉粥样硬化的机制尚不清楚。本文我们发现Sema7A响应血管血液扰动流,在血管内皮细胞表达上调、通过与其相应的受体α1β1相互作用,促进动脉粥样硬化;在探索转化医学应用方面,我们发现Sema7A血清水平与动脉粥样硬化血栓性脑卒中相关,提示其在相关疾病中作为生物标志物的潜在应用前景。目的:探究轴突导向分子Sema7A调控动脉粥样硬化发生发展的分子机制,为动脉粥样硬化的临床干预提供理论依据。研究方法:本项目将利用多种基因敲除小鼠,结合细胞与分子生物学技术,研究Sema7A促进动脉粥样硬化发病机制,探索轴突导向分子对动脉粥样硬化发生发展过程中内皮细胞表型变化以及炎症细胞浸润的影响以及Sema7A在临床上动脉粥样硬化的诊断和治疗的转化研究。1.内皮细胞Sema7A分子表达与血液扰动流和内皮细胞功能之间的调控作用。(1)血管内皮Sema7A的表达规律。前期发现Sema7A的敲除可以显著减少主动脉的脂质沉积和动脉粥样硬化斑块的形成,并且斑块的减少主要集中在主动脉弓部,即血液扰动流出现的位置。为了检测Sema7A是否响应血液扰动流,我们检测血管暴露在血液扰动流的主动脉弓部以及血液稳定层流的降主动脉干部内皮细胞中Sema7A的表达水平。同时我们将通过在体的颈动脉部分结扎模型和体外内皮细胞的震荡流模型人为构建更纯粹的血液扰动流模型,确定Sema7A的表达与血液扰动流之间的联系与规律,为下一步的实验计划和设计做铺垫。(2)内皮Sema7A分子表达的转录调控。我们发现在血液扰动流区域,血管内皮细胞Sema7A蛋白及m RNA水平较层流区域显著上调,提示转录调控在Sema7A表达中发挥重要作用。通过Qiagen数据库分析Sema7A基因序列,发现其启动子区域包含多个血流剪切力相关转录因子的结合位点,推测这些转录因子可能介导了血液扰动流下Sema7A表达的上调,因此我们将研究转录因子调控Sema7A表达活性的变化与影响。(3)血液扰动流情况下,Sema7A缺失对或高表达对内皮细胞粘附分子表达的影响。选择素selectins,粘附分子ICAM-1,VCAM-1是介导白细胞滚动、粘附和浸润的主要粘附分子,血液扰动流情况下,Sema7A缺失或高表达可能对主要粘附分子的表达有影响,我们将通过蛋白质组学实验以及配受体作用实验对Sema7A调控粘附分子的作用方式及机制进行探究。2.Sema7A敲除对白细胞滚动、粘附和浸润,以及对动脉粥样硬化斑块形成的影响。(1)Sema7A细胞特异性敲除对Sema7A及其受体α1β1介导的白细胞滚动、粘附和浸润的影响。通过在体以及体外诱导炎症模型,检测炎症条件下白细胞在内皮层内的滚动粘附浸润情况。并利用α1β1特异性阻断抗体以及Sema7A敲除细胞,进而论证内皮层上白细胞滚动粘附与Sema7A及其受体α1β1的相互作用密不可分。(2)利用骨髓移植结合颈动脉斑块模型,分析各组处理鼠间斑块形成过程的不同。利用小鼠喂食高脂饲料构建动脉粥样硬化诱导模型结合实验室现已掌握的颈动脉部分结扎手术模型,观测不同来源Sema7A对动脉粥样硬化斑块形成的影响,进而探究不同来源的Sema7A对动脉粥样硬化形成过程的不同作用。3.Sema7A与临床急性动脉粥样硬化血栓性卒中(AAS)患者关系。鉴于Sema7A通过对血液扰动流的响应及其介导白细胞浸润等一系列的病理作用参与动脉粥样硬化的发生发展,因此以Sema7A为靶点进行转化应用方面的研究十分必要。在脑动脉粥样硬化或颈动脉粥样硬化患者中,易损斑块的破裂可能导致急性血栓形成,阻止血液供应到大脑。这种称为急性动脉粥样硬化血栓性卒中(AAS)的疾病是危及生命的心血管疾病之一,为了探索Sema7A与临床急性动脉粥样硬化血栓性卒中之间的联系。我们检测健康对照组与急性动脉粥样硬化血栓性卒中组患者血清中可溶性Sema7A水平,通过校正已知心血管危险因素和基线协变量(包括体重指数,低密度脂蛋白胆固醇,高密度脂蛋白胆固醇,甘油三酯,总胆固醇,空腹血糖,吸烟和饮酒状态)后,衡量血清Sema7A水平升高是否是急性动脉粥样硬化血栓性卒中的独立危险因素,进而为Sema7A的临床应用提供实验基础和理论依据。结果:1.通过硅片启动子分析并在人类和小鼠Sema7A启动子区域中鉴定了c AMP反应元件结合蛋白(CREB)的潜在结合位点,CREB是已知对剪切应激反应的转录因子。利用信号通路抑制剂我们发现内皮Sema7A分子的转录表达受PKA-CREB信号传导调控,且这些数据表明抑制PKA/CREB信号传导可能是血液扰动流诱导的内皮Sema7A表达的潜在机制。2.主动脉弓部以及结扎的左颈动脉即血液扰动流情况下Sema7A的表达上调可以显著上调此处粘附分子ICAM-1以及VCAM-1的表达。3.利用过表达细胞系,我们阐明的内皮Sema7A的表达上调可以通过受体α1β1活化粘着斑激酶信号通路及下游NFκB信号通路,启动粘附分子ICAM-1/VCAM-1的转录上调,促进白细胞的滚动与粘附。4.内皮细胞上表达的Sema7A在动脉粥样硬化斑块形成过程中发挥重要作用,利用骨髓移植结合颈动脉斑块模型,我们发现内皮Sema7A特异性敲除可以显著减少动脉粥样硬化斑块脂质的沉积。5.我们测量了AAS患者和年龄和性别匹配的健康对照中血清Sema7A的水平。与对照组相比,AAS患者血清Sema7A水平显著升高。校正已知心血管危险因素和基线协变量(包括体重指数,总胆固醇,甘油三酯,低密度脂蛋白胆固醇,高密度脂蛋白胆固醇,空腹血糖,吸烟和饮酒状态)后,AAS患者血清Sema7A水平仍然升高很明显,这个结果表明Sema7A是急性动脉粥样硬化血栓性卒中的独立危险因素,并可能成为一种新的诊断标志物。结论:1.Sema7A受血液扰动流调控表达上调,通过受体整合素α1β1介导内皮细胞间的相互作用,导致粘附分子表达上调和内皮功能紊乱,进而促进白细胞滚动粘附和动脉粥样硬化的发展。2.临床急性动脉粥样硬化血栓性卒中(AAS)病人血清中Sema7A的水平显著升高,是AAS的独立危险因素。3.靶向Sema7A可能为临床性动脉粥样硬化的病程诊断及有效治疗提供重要的理论基础及有力的实验依据。