论文部分内容阅读
法夫酵母具有极大的商业价值,其生产的类胡萝卜素尤其虾青素被广泛应用在水产养殖、医药、保健品、化妆品等行业中。野生型法夫酵母菌株的虾青素生产水平较低,如何提高法夫酵母的虾青素产量一直是研究的热点。法夫酵母的虾青素合成途径及其调控机理的深入探索对天然虾青素资源的开发具有极其重要的意义。为进一步探索法夫酵母的虾青素代谢规律,了解合成途径相关基因的功能关系以及调控机理,和进一步以法夫酵母为生物技术平台构建具有商业价值的工程菌株,本文利用基因敲除等技术主要展开了以下研究内容:首先,利用PCR扩增技术,克隆虾青素高产菌株JMU-MVP14的八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶基因(crtYB)和虾青素合成酶基因(asy),考察不同虾青素生产水平的法夫酵母菌株的crtYB基因和asy基因的一致性差异。结果表明,虾青素高产菌株JMU-MVP14的crtYB基因序列及其编码的氨基酸与已报道的crtYB基因序列(登入号DQ016503)及编码的氨基酸的一致性分别为99.3%和100%;asy基因序列与已报道的asy基因序列(登入号DQ201828和EU713462)的一致性分别为99.9%和99.7%,其编码的氨基酸与已报道的asy基因序列(登入号DQ201828和EU713462)编码的氨基酸的一致性分别为100%和99.8%。不同虾青素生产水平的法夫酵母菌株的crtYB基因或asy基因的一致性差异不明显。接着,根据法夫酵母的crtYB基因序列和asy基因序列设计引物,克隆crtYB基因和asy基因的同源臂片段,分别构建法夫酵母的crtYB基因敲除载体pMD-△crtYB,大小约6600 bp和asy基因敲除载体pMD-△asy,大小约7700 bp。然后,对法夫酵母的虾青素高产菌株JMU-MVP14和虾青素低产菌株JMU-VDL668进行crtYB基因敲除,考察crtYB基因敲除对菌株生长及产类胡萝卜素的影响。较之相应的出发菌株,crtYB基因敲除菌株的菌落呈白色,且不产生类胡萝卜素。菌株JMU-MVP14的crtYB基因敲除菌株JMU-MVP△crtYB的生长变化不明显,脂肪酸产量降低43.15%,麦角固醇产量提高53.62%;菌株JMU-VDL668的crtYB基因敲除菌株JMU-MVP△crtYB的生物量积累提高约35%,脂肪酸产量降低55.43%,麦角固醇产量提高15.80%。最后,对法夫酵母菌株JMU-MVP14和JMU-VDL668进行asy基因的敲除,分别获得菌株JMU-MVP△asy和JMU-VDL△asy。asy基因敲除菌株的菌落形态变化不明显,生物量积累没有受到明显的影响。在发酵过程中,菌株JMU-MVP△asy的总类胡萝卜素产量和β-胡萝卜素产量都较出发菌株低;其虾青素的产量在0-24 h与出发菌株水平相当,在24-56 h较出发菌株低,在56 h后超过出发菌株的产量并最终略高于出发菌株的产量。而菌株JMU-VDL△asy的总类胡萝卜素产量在发酵前期的0-24 h与出发菌株相当;在24-48 h较出发菌株低;在48 h之后始终超过出发菌株的产量。在发酵前期的0-8 h,菌株JMU-VDL△asy与出发菌株的细胞浸提液中都检测不到虾青素;在8-40 h,其虾青素产量较出发菌株低;在48 h之后,其虾青素产量超过出发菌株的产量并最终高出出发菌株的产量约25%。整个发酵过程中,菌株JMU-VDL△asy及其出发菌株的细胞浸提液中都没有检测到β-胡萝卜素。