苦丁茶是一种中国传统的保健饮料,其资源丰富,广泛分布于广东、广西、云南、海南等地,已有超过2000年的饮用、药用历史。经长期实践验证,它具有显著的解毒消炎、化瘀活血、降血压血脂、清心明目、抗癌等功效。绿原酸作为苦丁茶的主要有效成分,广为人知的是其抗炎和抗氧化作用,关于绿原酸抑制血管生成的相关研究鲜有报道,本实验旨在研究苦丁茶提取物抗血管生成的作用机制,为苦丁茶应用于医药产业提供理论依据。本研究课题以苦丁茶冬青和转基因(FLK-l:eGFP)斑马鱼模型为主要实验材料,具体实验方法与步骤如下:1.应用可实现高通量筛选的转基因(FLK-1:eGFP)斑马鱼模型,通过培养液加药的方式,评估提取物对斑马鱼胚胎新生血管的抑制效果;2.通过吖啶橙染色法检测加药后斑马鱼胚胎细胞的凋亡情况;3.应用同位素标记相对和绝对定量(i-TRAQ)法检测转基因(FLK-1:GFP)斑马鱼胚胎加药后的差异蛋白;4.通过软件MOE(Molecular Operating Environment)将筛选出的差异蛋白和绿原酸进行分子对接,对具有绿原酸活性结合位点的蛋白进行免疫印迹验证,由此分析绿原酸衍生物对斑马鱼胚胎新生血管抑制的分子机制。具体实验结果如下:1.转基因(FLK-l:eGFP)斑马鱼的胚胎在受精后36～52小时接受了苦丁茶提取物和绿原酸处理,结果显示,苦丁茶提取物在浓度400和500 μg/mL时,显著减弱新生血管荧光,在浓度500 μg/mL时显著减小节间血管直径;绿原酸在浓度80,100和130μg/mL时,显著减弱新生血管荧光,在浓度100和130 μg/mL时,显著减小节间血管直径;2.细胞凋亡检测显示,苦丁茶提取物和绿原酸分别在100～500 μg/mL和40～130μg/mL浓度下剂量依赖性增加斑马鱼胚胎背主动脉附近细胞的凋亡;3.转基因(FLK-l:eGFP)斑马鱼的胚胎在受精后36～52小时接受绿原酸处理后,应用同位素标记相对和绝对定量(i-TRAQ),筛选出了 10个与细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)相关的差异蛋白;通过软件 MOE(Molecular Operating Environment),将这 10个差异蛋白和绿原酸分子进行对接,只发现了 MAP4K5(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 5)具有结合绿原酸的活性位点;4.蛋白质印迹显示,苦丁茶提取物和绿原酸均可诱导ERK的磷酸化水平升高。终上所述,CGA和MAP4K5结合诱导了血管内皮细胞的凋亡;CGA引起ERK的磷酸化,导致血管生成的抑制,然而凋亡和ERK的磷酸化之间相关关系始终不清楚,但这不影响苦丁茶绿原酸提取物称为有潜力的治癌药物或食品添加剂。