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背景:肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)作为慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的重要并发症之一,直接影响了COPD患者的生活质量和预后。吸烟是COPD最主要的危险因素,一系列临床组织标本和动物模型结果表明:吸烟COPD患者的早期无低氧阶段,甚至在肺功能完全正常的吸烟人群,肺血管重构的现象就已经开始出现,其机制可能和吸烟致高氧化应激状态和慢性炎症有关。近年来调控细胞能量代谢平衡的腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作为调控机体氧化应激和炎症反应的重要靶点备受关注。在糖尿病和肥胖患者中,其体内AMPK低活性状态与该类患者机体高氧化应激状态和慢性炎症、心血管合并症的发病率密切相关。AMPK的激活对于维持正常血管的正常结构和功能十分重要。目前关于AMPK与体循环疾病,如动脉粥样硬化和球囊损伤后再狭窄的研究结果,几乎得出了一致的结论——上调AMPK活性可以保护内皮细胞功能,抑制动脉平滑肌细胞增殖。随着对AMPK研究的深入,逐渐认识到其关键亚型AMPKα1和AMPKα2,似乎在维持血管稳态中所起的作用不尽相同。肺血管重构是PH的基本病理特征,其中肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)表型转化——从收缩型(分化)向合成型(未分化)转化是获得异常增殖/迁移、合成分泌能力,导致肺血管重构和PH形成的前提和基础。而香烟暴露下所致高氧化应激和炎症环境是COPD合并PH发生的基础,我们推测调控氧化应激和慢性炎症的靶点——AMPK极有可能在调控香烟暴露下PASMCs的表型转化和增殖中发挥重要作用,有必要对其机制深入探讨。传统降糖药物二甲双胍是AMPK的激活剂,动物实验表明二甲双胍抑制野百合碱诱导的肺动脉高压形成,此项研究虽然未直接探讨其机制,但初步证实了二甲双胍可能对肺循环具有保护作用。本项目拟探讨AMPK及其不同亚型在香烟暴露下PASMCs的表型转化和过度增殖中的作用;阐明二甲双胍是否通过激活AMPK或特定AMPK亚型抑制肺血管重构的关键环节——PASMCs的表型转化和过度增殖。在目前COPD相关肺动脉高压尚缺乏有效治疗手段的背景下,一旦我们的假设得以验证,将有助于阐明吸烟致COPD相关PH的分子机制,并为其早期防治提供新思路。研究目的:1.研究吸烟、全身炎症水平与PH之间的关系;2.明确AMPKα2在香烟提取物(cigarette smoking extract,CSE)诱导的大鼠PASMCs表型转化中的作用。3.明确AMPKα2在二甲双胍抑制香烟暴露下PASMCs表型转化和增殖中的作用。研究方法:1.采用病例对照研究设计,以2013年4月-2015年3月111例入住我科的COPD合并PH患者作为病例组,匹配年龄、性别后以同期111例COPD未合并PH的住院患者作为对照组。采集患者年龄、性别、吸烟史、血沉(ESR)、白细胞(WBC)、中性粒细胞/淋巴细胞比例(NLR)、血清C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、纤维蛋白原(FIB)、降钙素原(PCT)、动脉血气、胸部CT及心脏彩超等结果。使用SPSS 22软件对两组数据进行统计学差异比较,并进行相关性分析及多因素Logistic回归分析找出PH的相关危险因素;2.5%CSE处理体外分离培养大鼠PASMCs,采用CCK-8法检测细胞增殖,Western blot检测PASMCs表型标志物(SMA),AMPK、m TOR表达及其磷酸化水平。采用慢病毒介导的si RNA沉默PASMCs中AMPKα1和AMPKα2基因表达,明确不同亚型AMPKα在CSE诱导的PASMCs表型转化中的作用;3.观察二甲双胍对5%CSE暴露下PASMCs表型转化和增殖的影响,明确AMPKα2是否在其中起关键作用。研究结果:1.COPD合并PH组的吸烟指数、血清CRP、IL-6及TNF-α水平均明显高于COPD未合并PH组(p<0.05);2.吸烟指数、血清CRP、IL-6及TNF-α水平与肺动脉收缩压呈正相关(p<0.05),吸烟指数与CRP水平也呈正相关(p<0.05);3.多因素Logistic回归分析结果显示吸烟指数、血清CRP、IL-6及TNF-α水平是肺动脉高压形成的独立危险因素(OR值分别为6.185、6.740、3.434、2.700,p<0.05);4.CCK-8结果显示5%CSE促进大鼠PASMCs增殖,Western blot结果显示5%CSE可以下调PASMCs收缩表型标志物SMA的表达(p<0.05);5.采用慢病毒介导的si RNA技术成功将大鼠PASMCs中的AMPKα1、AMPKα2基因沉默后,Western blot结果显示AMPKα2 si RNA组的SMA表达明显下降(p<0.05);6.CCK-8结果显示二甲双胍明显抑制5%CSE促PASMCs的增殖效应(p<0.05);二甲双胍无法抑制AMPKα1 si RNA组和AMPKα2 si RNA组PASMCs的增殖;7.Western blot结果显示二甲双胍可以逆转5%CSE诱导的SMA表达下调(p<0.05);8.Western blot结果进一步证实二甲双胍通过激活AMPKα2/m TOR途径抑制5%CSE致PASMCs表型转化,维持PASMCs正常表型。研究结论:1.吸烟、全身炎症反应(CRP、IL-6、TNF-α水平增加)是肺动脉高压发生的独立危险因素;2.吸烟及血清CRP、IL-6、TNF-α与肺动脉收缩压呈正相关,吸烟指数与血清CRP呈正相关;3.体外实验证明5%CSE促进大鼠PASMCs增殖,并下调PASMCs收缩表型标志物SMA的表达,使PASMCs发生表型转化;4.AMPKα2在CSE诱导的PASMCs表型转化中发挥重要作用;5.二甲双胍可以逆转5%CSE诱导的SMA表达下调,从而维持PASMCs正常表型,抑制其过度增殖,其机制依赖于AMPKα2的活化。