【摘 要】
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HN8623, HN6868, HN3831是从我国珍稀蜘蛛品种海南捕鸟蛛粗毒(Haplopema hainanum)中分离纯化到的三个新型多肽类神经毒素,它们的相对分子质量分别为8623.732,6869.095,3830.
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HN8623, HN6868, HN3831是从我国珍稀蜘蛛品种海南捕鸟蛛粗毒(Haplopema hainanum)中分离纯化到的三个新型多肽类神经毒素,它们的相对分子质量分别为8623.732,6869.095,3830.973。初步的电生理实验证明这三个多肽都能激活辣椒素受体(TRPV1),产生能被钌红阻断的钙电流,并呈现浓度和时间依赖性。在同等浓度情况下,HN8623的激活作用最强；1μmol/LHN8623就能显著地激活TRPV1通道,而高浓度的HN6868却能持续的打开TRPV1通道。Edman降解测序己测得HN8623的部分序列,与新发现的双工CK分子(DKTX)进行序列同源性比对,发现有大约76%的序列同源性,因此推测HN8623可能是个双ICK模体分子,具有很大的研究价值。Edman降解法测得HN6868的全序列：ACSKQIGDKCKRNCECCGKTVVCGTIYVGGKEVNQCMDKTSDNAILNGLGKGMNFIENTFSFCV.该分子由64个aa构成,含有8个半胱氨酸4对二硫键。该分子最大的特点就是能持续激活TRPV1通道,使钙离子内流,细胞长时间兴奋从而对外界刺激不敏感,因此该分子可能有镇痛的效果。Edman降解测得HN3831的序列是：ECRYWLGTCSKTGDCCSHLSCSPKHGWCVWDWT.该分子由33个aa构成,含有3对二硫键,推测其可能是个典型的ICK模体分子。利用电生理技术及其表达在HEK293细胞上的各钠钾通道亚型对以上三个分子进行离子通道作用的专一性研究表明,HN8623和HN6868只能激活TRPV1通道,而对其它的钠钾电压门控离子通道都没有作用。HN3831除能轻微地激活TRPV1通道外,还能显著地抑制Kv4.2和Kv4.3钾通道电流,这种抑制作用具有浓度依赖性和时间依赖性,其半数有效抑制浓度(IC50值)分别为299.6nmol/L和114.5nmol/L。HN3831还能够使Kv4.2和Kv4.3的稳态激活曲线,稳态失活曲线和失活恢复曲线发生相应的漂移来改变通道的动力学特征。进一步的电生理实验证明HN3831对表达在DRG上的TTX-R电流没有作用,却能轻微的抑制TTX-S电流,其半数有效抑制浓度是1.854μmo1/L.为了进一步研究HN3831与Kv4.3通道相互作用的分子机制,本实验运用点突变的方法设计和构建了19个Kv4.3通道S1-S2片段和S3b-S4片段胞外连接环上的突变体。运用电生理技术检测HN3831对上面突变体的抑制活性,发现HN383 1对S3b-S4上面V282A突变体的抑制活性下降最大,其IC50是野生型的5.37倍。因此推测S3b-S4胞外环上第282位氨基酸是HN3831与Kv4.3发生相互作用的关键性位点。
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