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目的:本研究旨在通过动物实验再次验证本课题组前期实验构建的AD-HPV16/18/58mE6E7三价重组腺病毒载体治疗性疫苗对表达HPV58型E6E7融合基因的荷瘤小鼠的细胞免疫效果,并且继续通过动物实验验证新型疫苗对表达HPV16、18型E6和(或)E7基因的荷瘤小鼠的免疫效果,为今后子宫颈癌前病变及恶性肿瘤的免疫治疗提供实验基础和候选疫苗。方法:1、查找并验证稳定表达HPV16型E6和E7蛋白的鼠源宫颈癌细胞系:通过细胞公司购买HPV16的E6、E7及ras基因共转化的C57BL/6(H-2b)小鼠子宫颈癌TC-1细胞株,并通过RT-PCR及Western Blot实验再次验证该细胞系HPV16E6、E7基因和蛋白的表达情况。2、表达HPV16型E6和E7基因的小鼠成瘤及验证:利用扩大培养并验证后的TC-1细胞系对C57BL/6小鼠进行右背部皮下成瘤实验,并通过RT-PCR、WB验证成瘤小鼠肿瘤组织内HPV16E6、E7基因和蛋白的表达情况。3、构建并验证稳定表达HPV18型E6E7融合蛋白的鼠源宫颈癌细胞系:本课题组结合前期成功构建稳定表达HPV58型E6E7融合蛋白的U14细胞系(小鼠来源宫颈癌细胞株,HPV阴性)的经验,将已构建成功的稳定表达HPV18E6E7融合基因的带绿色荧光的慢病毒系统转染小鼠子宫颈癌U14细胞。转染成功扩大培养后,利用RT-PCR及Western Blot实验验证新构建的稳定表达HPV18E6E7融合蛋白的鼠源U14细胞系(命名为:U14/LV-HPV18E6E7)。4、表达HPV18型E6E7融合基因的小鼠成瘤及验证:利用扩大培养并验证后的U14/LV-HPV18E6E7细胞系对C57BL/6小鼠进行右背部皮下成瘤实验,并通过RT-PCR、WB验证成瘤小鼠肿瘤组织内HPV18E6E7融合基因和蛋白的表达情况。5、新型疫苗免疫效果研究:分别以稳定表达HPV16 E6和E7基因、HPV18、58E6E7融合基因的小鼠成瘤细胞系构建荷瘤小鼠模型,用前期构建的AD-HPV16/18/58mE6E7三价重组腺病毒载体治疗性疫苗免疫小鼠,通过皮下移植瘤形态学、移植瘤生长情况、肿瘤抑制率以及小鼠生存情况的观察;血清抗体ELISA、ELISPOT、特异性CTL杀伤等体液免疫和细胞免疫的检测,评价新型疫苗对抗HPV16、18、58型肿瘤的效果。结果:1、通过RT-PCR和Western-Blot实验验证了鼠源子宫颈癌TC-1细胞在体外、体内均可稳定表达HPV16E6和HPV16E7基因。2、成功构建稳定表达HPV18E6E7融合基因的U14细胞系(U14/LV-HPV18E6E7),且通过RT-PCR和WB实验证实该细胞系可在体内外稳定表达HPV18E6E7融合基因。3、通过动物实验验证了新型三价治疗性腺病毒载体疫苗的免疫效果:经疫苗免疫后的C57BL/6小鼠在一定程度上能分别抑制表达HPV58E6E7融合蛋白、HPV16E6和E7蛋白、HPV18E6E7融合蛋白的小鼠子宫颈癌细胞U14的生长,能产生有效的体液和细胞免疫,保护免疫小鼠免受移植瘤的攻击。(1)在抗移植瘤保护实验研究中:疫苗对抗HPV58型、HPV16型和HPV18型肿瘤细胞作用的基本相同,疫苗组小鼠皮下移植瘤成瘤潜伏期长于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);疫苗组小鼠肿瘤生长速度较对照组缓慢,肿瘤平均瘤重较对照组明显减低,生存期较对照组延长,差异具有显著性(P<0.05)。(2)体液免疫血清特异性抗体检测实验(ELISA实验)研究中:疫苗对抗HPV58型、HPV16型和HPV18型肿瘤细胞的体液免疫作用的基本相同,免疫小鼠可分别诱发针对HPV58型E6和E7、HPV16型E7、HPV18型E7抗原表位多肽的血清特异性抗体,抗体效价最高均达1:25600,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)细胞免疫ELISPOT实验研究中:疫苗对抗HPV58型、HPV16型和HPV18型肿瘤细胞的细胞免疫作用的基本相同,通过该实验已分别检测到HPV58型E6和E7、HPV16型E7、HPV18型E7抗原表位多肽诱导的特异性分泌IFN-γ的效应T细胞,且所有疫苗组小鼠ELISPOT的斑点数均明显多于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)细胞免疫细胞毒性T细胞杀伤实验研究中:疫苗对抗HPV58型、HPV16型和HPV18型肿瘤细胞的细胞免疫作用的基本相同,乳酸脱氢酶法(LDH)检测到AD-HPV16/18/58mE6E7腺病毒载体疫苗对杀伤U14/LV-HPV58E6E7细胞、TC-1细胞、U14/LV-HPV18E6E7细胞的CTL反应最高分别达33.050%、30.160%、30.890%。结论:本研究成功构建了稳定表达HPV18E6E7融合蛋白的鼠宫颈癌U14细胞系,并系统验证了新型三价治疗性腺病毒载体疫苗AD-HPV16/18/58mE6E7能分别在HPV16、18、58型肿瘤小鼠体内诱导产生有效的体液和细胞免疫,证实了该疫苗的免疫保护和免疫治疗作用,可以作为今后HPV16、18、58型相关子宫颈癌前病变及宫颈癌的免疫治疗候选疫苗。另外,通过免疫实验进一步验证前期本课题组筛选的HPV58型E6和E7 HLA-A2限制性CTL表位抗原多肽的免疫原性,推选HPV58E6肽作为后续实验研究的首选HPV58型表位抗原多肽。