【摘 要】
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细丝蛋白A（Filamin A）是一种肌动蛋白的交联蛋白,在细胞黏附和迁移过程中起到关键作用。细丝蛋白A可以介导机械信号转导,即细胞感知机械力并将物理信号转化为生化信号,从而赋予细胞适应其周围环境的能力。FLNA由两个相同的亚基组成,每个亚基包含24个重复片段,FLNA和它的结合分子的相互作用主要发生在重复片段16-23（R16-23）处。FLNA的R21的CD面被来自R20的A链占据,阻止了FL
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细丝蛋白A（Filamin A）是一种肌动蛋白的交联蛋白,在细胞黏附和迁移过程中起到关键作用。细丝蛋白A可以介导机械信号转导,即细胞感知机械力并将物理信号转化为生化信号,从而赋予细胞适应其周围环境的能力。FLNA由两个相同的亚基组成,每个亚基包含24个重复片段,FLNA和它的结合分子的相互作用主要发生在重复片段16-23（R16-23）处。FLNA的R21的CD面被来自R20的A链占据,阻止了FLNA与其配体的相互作用,当删除掉FLNA上包含R20的A链的41个氨基酸后,这个FLNA的变异体（FLNA del41）与整联蛋白的相互作用显著增强。在此基础上,研究者提出机械力诱导FLNA的R21发生构象改变,R20的A链从CD面上解离,从而暴露结合位点的观点。实验室前期研究确定了SAV1作为细丝蛋白A新的结合伴侣。为了探讨FlnaSav1在小鼠体内的生物学功能,我们利用Cre-loxp系统产生突变Sav1肝脏特异性敲入小鼠。在此模型中,Sav1不能与Flna结合。基因分型结果进一步验证了肝脏的特异性突变SAV1敲入。我们初步发现纯和突变小鼠的肝脏凋亡信号增加。在细胞水平上,利用Crispr-Cas9构建了SAV1-KO细胞系。大量研究表明YAP的定位会受到机械力的调节,具体表现在细胞基质硬度,细胞密度等。在宫颈癌（Hela）细胞中,我们观察到了SAV1缺失抑制了高密度下YAP的细胞质穿梭且统计学差异明显。同时我们构建了eGFP,HA,Flag和无标签的SAV1野生和突变型载体。后期的研究中我们初步尝试把SAV1野生和突变型载体瞬时转染进KO细胞系,观察野生和突变型SAV1对Hippo信号通路终端分子YAP的影响。通过比对分析免疫荧光结果,没有观察到显著性差异。初步推测这可能与瞬时转染的局限性以及SAV1本身二聚体有关系。同时,我们以R21-22为亲和配体,通过细胞培养条件下稳定同位素标记（SILAC）技术,我们确定了G3BP1是FLNA的一个新的受机械力调节的结合伴侣。这种相互作用是独特的,G3BP1不与标准全长FLNA相互作用,但暴露于FLNA R21的结合位点使G3BP1能够相互作用。与其他FLNA与R21的结合伴侣不同,G3BP1需要FLNA的相邻R22相互作用。我们绘制了G3BP1上的FLNA结合位点,发现Phe360Ala点突变破坏了相互作用。对G3BP1和G3BP2的蛋白质序列进行比对,我们发现G3BP2具有相似的结合序列,但GST蛋白拉下实验结果发现并非如此,因此我们推测R21的结合位点对它们的相互作用是必需的,但并不充分,因此G3BP2不与FLNA相互作用。我们研究了G3BP1和FLNA在人胚肾细胞（HEK 293A）、和人骨骼肌细胞（hs SKM）这些细胞中的定位。RNA干扰FLNA-G3BP1相互作用,FLNA不定位于RNA富集的应激颗粒中。此外,G3BP1的Ser149的磷酸化和去磷酸化对相互作用没有影响。荧光光漂白后的荧光恢复实验数据表明,它们相互作用稳定了活细胞胞浆中的G3BP1。综合考虑,我们确定了G3BP1是一种新的肌动蛋白交联蛋白,它与FLNA机械传感域R21相互作用,提示应激颗粒的形成可能受到机械力的调节。
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