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背景:尽管现代医学已经取得了巨大的进步,但是卵巢恶性肿瘤的发病率和死亡率仍居高不下。人类基因组图谱的绘制以及人类基因组研究的蓬勃兴起,为从源头上防治恶性肿瘤提供了新的途径。近期的大量研究表明,人类基因组中与细胞增殖分化相关癌基因的激活和抑癌基因的失活与恶性肿瘤的发生、发展密切相关,在此基础上出现了对恶性肿瘤进行基因治疗的理论和实践探索。寻找和确定有治疗意义的目的基因是实施肿瘤基因治疗的前提。RNA干扰(RNA interfering,RNAi)是一种由长约21-23个核苷酸的双链RNA分子(double-stranded RNA, dsRNA)引起的转录后基因沉默,以序列特异的方式抑制同源基因的表达,其副作用小,特异性高。RNAi是生物界普遍存在的一种调控基因表达的有效方式和鉴定基因功能的重要手段,具有高效特异阻断基因表达的特点,在基因功能研究、信号转导通路研究以及基因治疗中得到广泛的应用。近年来,小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在肿瘤基因治疗方面取得了重大进展。通过向肿瘤细胞内导入能稳定表达siRNA分子的质粒或病毒载体来研究特定癌基因或抑癌基因的功能。GATA-3是调节T细胞发育和分化的重要的转录因子,在胸腺细胞早期发育和Th2细胞的分化过程中发挥了重要作用,诱导Th2类细胞因子的分泌,介导体液免疫应答。近年研究发现GATA-3在人类乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、食道癌等肿瘤中表达异常。本课题组在前期研究中发现GATA-3在卵巢癌细胞株HO-8910等多种肿瘤细胞株中均有表达,经查阅国内外文献,未发现类似报道。GATA-3的表达对恶性肿瘤细胞生物学特征的影响及其在免疫逃逸的发生、发展中所起作用目前尚不完全明了。我们设想通过RNAi在转录水平上实现对卵巢癌细胞中GATA-3表达水平的调控,观察该方法对卵巢癌细胞生物学特征的影响,从而为将来该方法在临床上的应用提供理论和实验依据。目的:探讨利用逆转录病毒介导的siRNA的方法能否有效的介导肿瘤细胞出现RNAi,观察其对GATA-3基因表达的抑制作用和对卵巢癌细胞株HO-8910生物学行为的影响。方法:①设计、构建及鉴定GATA-3/siRNA-1、GATA-3/siRNA-2和GATA-3/ siRNA -negative重组逆转录病毒表达载体。②GATA-3/siRNA-1、GATA-3/siRNA-2和GATA-3/siRNA-negative重组载体在脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PT67中,嘌呤霉素筛选并挑选细胞克隆。收获的病毒上清液转染卵巢肿瘤细胞HO-8910,经过嘌呤霉素筛选得到稳定转染的细胞株HO-8910/siRNA-1、HO-8910/siRNA-2和HO-8910/siRNA-negative。通过RT-PCR和免疫组化方法鉴定GATA-3表达的抑制效果。③通过MTT检测细胞增殖以及对顺铂的敏感性,通过流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡。④将稳定转染的细胞株HO-8910/siRNA-1、HO-8910/siRNA-2、HO-8910/siRNA-negative及HO-8910种植到裸鼠皮下检测成瘤情况。结果:①成功构建GATA-3/siRNA-1、GATA-3/siRNA-2和GATA-3/siRNA-negative重组逆转录病毒表达载体。②建立了稳定抑制GATA-3基因表达的细胞株HO-8910/siRNA-1、HO-8910/siRNA-2和对照组HO-8910/siRNA-negative③HO-8910/siRNA-1细胞株的G0/G1期细胞占(66.3±10.3)%, S期细胞占(8.6±1.2 )%,G2/M期占(27.1±3.4)%;HO-8910/siRNA-2细胞株的G0/G1期细胞占(64.3±14.6 )%, S期细胞占(7.9±0.9 )%,G2/M期占( 26.2±2.9 )%;而HO-8910/siRNA-negative细胞株的G0/G1期细胞则占(50.3±9.1)%, S期细胞占(9.2±1.5)%,G2/M期占(33.6±4.7)%; HO-8910细胞株的G0/G1期细胞则占(46.3±5.2)%,S期细胞占(8.9±0.7)%.,G2/M期占(35.5±6.1)%。④HO-8910/siRNA-1细胞株早期凋亡(0.05±0.01)%、HO-8910/siRNA-2细胞株早期凋亡(0.04±0.01)%,HO-8910/siRNA- negative细胞株早期凋亡(0.03±0.01)%,HO-8910细胞株早期凋亡(0.03±0.01)%,差异无显著性(P﹥0.05)。⑤与HO-8910/siRNA-negative细胞株相比,HO-8910/siRNA-1、HO-8910/siRNA-2细胞株增殖速度减慢(P<0.05),在顺铂的作用下,这种转染组的生长受到抑制更为明显。接种于裸鼠皮下的肿瘤生长明显减慢(P<0.01)。结论:①由逆转录病毒载体介导的siRNA可以有效抑制GATA-3基因的表达。②抑制卵巢癌细胞株HO-8910细胞的GATA-3基因表达后,卵巢癌细胞株HO-8910停滞于G0/G1期的细胞增多,细胞的生长速度也减慢,并且接种裸鼠的肿瘤生长速度明显受抑。③抑制卵巢癌细胞株HO-8910细胞的GATA-3基因表达后,卵巢癌细胞株HO-8910对顺铂的敏感性增加。因此,抑制GATA-3基因的表达可能影响卵巢癌细胞株HO-8910的恶性生物学行为。