蓝舌病（Bluetongue,BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）引起,通过媒介昆虫库蠓、伊蚊等进行传播的一种烈性非接触性传染病。蓝舌病主要感染反刍动物,其中纯种细毛羊最易感,死亡率可高达80%。世界动物卫生组织（OIE）将该病列为必须呈报的动物疫病,我国将其列为一类传染病。BTV的血清型众多,且各血清型之间无交叉保护作用。迄今为止,已发现29个血清型,呈全球性分布。自1979年我国首次发现该病至今已发现至少10种血清型存在,造成严重的经济损失。25型蓝舌病病毒是2008年在瑞士山羊血清中首次分离获得,目前在欧洲广泛流行,我国暂未有该病出现的报道,但随着进出口贸易往来日益频繁,该病随时可能传入我国,因此对BTV-25进行研究,建立稳定有效的血清学检测方法具有十分重要的意义。VP2蛋白由L2基因表达,各血清型之间差异较大,为BTV的主要型特异性抗原。针对NCBI上发表BTV-25 L2基因序列（EU839840）设计3对引物,以pET-28a（+）-VP2质粒为模板,分别PCR扩增BTV-L2和BTV-L2-A、B、C片段。将其克隆至真核表达载体pFastBac^TMHT B上获得重组质粒pFast-VP2、pFast-VP2-A、pFast-VP2-B、pFast-VP2-C。阳性重组质粒热转化至E.coli DH10bac感受态细胞中,获得重组杆粒BAC-VP2、BAC-VP2-A、BAC-VP2-B、BAC-VP2-C。将阳性重组杆粒BAC-VP2转染至Sf9昆虫细胞中获得重组杆状病毒BACV-VP2。经IFA及Western blot分析VP2蛋白在Sf9昆虫细胞上成功表达,能与鼠抗His抗体及鼠抗VP2蛋白抗体发生结合,证明其具有较好的抗原性。以本实验室保存的菌种pET-28a（+）-VP2-25A/BL21、pET-28a（+）-VP2-25B/BL21、pET-28a（+）-VP2-25C/BL21表达的His-25A、His-25B、His-25C作为免疫抗原,对SPF级的BALB/c小鼠进行腹腔免疫,采用细胞融合技术将完成免疫程序的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行体外细胞融合。以pMAL-c5X-VP2-25A/BL21、pMAL-c5X-VP2-25B/BL21、pMAL-c5X-VP2-25C/BL21菌种表达的MBP-25A、MBP-25B、MBP-25C作为检测抗原,对融合后的细胞进行筛选克隆。最终制备了12株能够稳定分泌抗BTV-25 VP2蛋白单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞,分别将其命名为:25A2B6、25A2C4、25A3E9、25A4H2、25B2G3、25B1H7、25B2F3、25B5D2、25C4B2、25C3E6、25C5G11、25C5E5。利用Sf9昆虫细胞上表达的VP2蛋白对所获得的单抗进行鉴定,经IFA及Western blot分析12株单抗细胞中有8株单抗与VP2真核蛋白发生特异性结合,分别为:25A2B6、25A2C4、25A4H2、25B2G3、25B1H7、25B2F3、25B5D2、25C4B2。将Sf9细胞感染BACV-VP2重组杆状病毒,用特异性较好的3株单抗25A2B6、25B2G3、25C4B2通过免疫电镜对VP2真核蛋白反应性进行鉴定,并对蛋白表达位置进行定位分析。结果显示3株单抗均与蛋白发生特异性结合,在Sf9细胞中细胞质及细胞核中均有金颗粒富集,证明VP2蛋白既在细胞核中表达也在细胞质中表达。利用噬菌体展示技术对25A2B6、25B2G3、25C4B2单抗识别的抗原表位进行鉴定,经过3轮噬菌体淘选,淘选后的噬菌体单链DNA测序并与BTV-VP2序列进行比对分析,推测出表位序列分别为:“³⁵⁹LYP³⁶¹”,“⁵⁸⁰NT⁵⁸¹”和“⁶²⁰TFR⁶²²”。通过进一步合成短肽序列,间接ELISA验证正确。将1-27型BTV的VP2蛋白氨基酸序列与表位序列进行比对分析,发现表位“³⁵⁹LYP³⁶¹”和“⁵⁸⁰NT⁵⁸¹”特异于BTV-25。而表位“⁶²⁰TFR⁶²²”相对保守,除了BTV-25含有该序列,BTV-4、10、11、17、20、24和27也含有该序列。本实验制备抗BTV-25 VP2蛋白的型特异性单克隆抗体并对抗体识别的抗原表位进行鉴定,旨在为建立BTV的型特异性免疫学检测方法的和VP2蛋白的功能研究奠定物质基础。