基因治疗为一些遗传性疾病提供了一种新的可选治疗方案。作为基因治疗中最常用的递送系统,AAV病毒载体的应用已在部分疾病的基因治疗研究中取得突破,并逐渐进入临床应用。近年来,以CRIPSR系统为主的新兴靶向基因编辑技术使得对哺乳动物细胞的基因修饰变得高效便捷,因此,基于腺相关病毒载体和CRISPR系统(AAV-CRISPR)为基础的基因治疗方案,为遗传疾病的治疗带来了希望。然而,作为外源物质的AAV病毒载体和CRISPR相关蛋白(Cas)在体内预先存在的适应性免疫,可能会极大削弱基因治疗的疗效,且存在未知的安全性风险。因此,研究AAV病毒和Cas蛋白在体内的适应性免疫对基因治疗的安全性和有效性评估至关重要。非人灵长类与人类基因组同源性高,在进化上关系密切且生理特性高度相似,因此在生物医学研究中,非人灵长类模型能很好地模拟人类疾病。为了探究非人灵长类体内预先存在针对AAV病毒和Cas蛋白的适应性免疫,我们开展了相关实验,主要研究内容和结果如下:第1部分:Cas蛋白的原核表达及蛋白纯化。设计并构建了SaCas9、SpCas9、AsCas12a、LbCas12a四种Cas蛋白的原核表达载体,利用IPTG诱导产生了重组蛋白,并通过固相化金属亲和层析分离纯化出了这四种蛋白。第2部分:三种动物血清中预先存在的AAV病毒和Cas蛋白抗体筛查。AAV病毒和Cas蛋白的特异性抗体可以通过Western Blot和ELISA间接法进行检测。我们对猕猴(恒河猴和食蟹猴)、狗和小鼠群体进行了广泛的抗体检测,使用重组AAV病毒或Cas蛋白作为抗原,检测血清中预先存在的特异性Ig G抗体。对AAV病毒抗体的ELISA检测结果显示,猴群体中广泛呈现出AAV8和AAV9病毒抗体阳性。同时,Western Blot和ELISA结果显示猴、狗和小鼠的血清中也普遍存在针对SaCas9、SpCas9、AsCas12a、LbCas12a四种Cas蛋白同源物的Ig G抗体。第3部分:猴和小鼠体内AAV病毒和Cas蛋白注射免疫监测。血清中预先存在的抗体只能反应当时的抗体强弱,而没法进一步判断适应性免疫应答的强弱。静脉注射重组AAV病毒和Cas蛋白可以激发适应性免疫应答,能有效模拟AAVCRISPR系统在体内面临的免疫反应,从而回答AAV-CRISPR用于全身性的基因治疗适应性免疫问题。我们通过对小鼠和猴体内注射低剂量的重组AAV9病毒和SpCas9蛋白并持续监测体液免疫和细胞免疫,结果显示重组AAV9病毒和SpCas9蛋白能有效触发二次体液免疫。同时,我们通过流式细胞术分析了低剂量AAV9病毒和SpCas9蛋白24h内的细胞免疫应答,结果显示低剂量的AAV9病毒和SpCas9蛋白的细胞免疫在监测期间并没有明显变化。结论:猴等动物体内普遍预先存在针对AAV病毒和Cas蛋白的适应性免疫。本研究对基于AAV-CRISPR系统进行基因治疗的方案制定和实施提供了参考依据。