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半夏（Pinellia ternate）是天南星科半夏属多年生草本药用植物,以干燥块茎入药。目前,从半夏中已分离检测到生物碱、甾醇类、氨基酸、有机酸类、黄酮类以及鞣质等多种化学成分,其中生物碱是半夏的主要药用成分。在半夏生物碱中,麻黄碱是主要活性成分且属于苯丙胺类生物碱,因其具有治疗支气管哮喘发作、各种原因引起的鼻黏膜充血、肿胀引起的鼻塞等功效而被应于临床治疗。但麻黄碱在半夏体内含量低,这严重影响了半夏药材的品质。为实现半夏麻黄碱含量的提高,利用植物代谢工程培育高产生物碱类药用植物具有十分重要的意义。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物体苯丙胺类生物碱代谢途径中的第一个关键酶,也是植物初级代谢和次级代谢之间的纽带。L-苯丙氨酸（L-Phe）是苯丙胺类生物碱合成的直接前体物质,在PAL催化下脱氨基生成反式肉桂酸（t-CA）,这是生物合成苯丙胺类次生代谢产物的第一步反应。但关于PAL在植物麻黄碱生物合成途径中的研究还有待深入。本研究以半夏为研究对象,从半夏转录组数据库中筛选到1条含完整读码框的候选unigene基因,命名为PtPAL。本试验采用RT-PCR方法克隆PtPAL基因的ORF序列,分析生物信息学、组织表达谱以及酶动力学;同时利用染色体步移方法克隆PtPAL基因的启动子序列,分析转基因拟南芥GUS组织化学染色,为进一步探究半夏麻黄碱代谢途径奠定基础。本试验主要的研究结果如下:1.半夏PtPAL基因的克隆、生物信息学和组织表达分析利用RT-PCR技术,克隆得到PtPAL基因的完整开放阅读框（ORF）序列。PtPAL基因的ORF序列长2289 bp,编码762个氨基酸,终止密码子为TAA。PtPAL氨基酸序列多重比对分析表明,PtPAL包含PAL-HAL、PLN02457、pheamlyase、Lyasearomatic及HutH结构域,属于苯丙氨酸解氨酶家族成员（LyaseIlike Superfamily）,与单子叶植物百合PAL相似度最高,达到78%。系统进化树分析表明,半夏PtPAL聚在单子叶植物这一类中,且与单子叶植物百合、菠萝和油棕亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR技术,分析PtPAL基因在不同组织的表达情况,结果表明PtPAL基因在叶中表达量较高,块茎和根中次之,花中表达量较少。2.半夏PtPAL基因原核表达、分离纯化和酶活性鉴定选择pET32a（+）作为原核表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达PtPAL重组蛋白。经过诱导和分离纯化,获得了融合His标签的PtPAL重组蛋白,分子量大小（MW）为102.3 kDa。通过LC-MS鉴定,PtPAL具有催化L-Phe形成t-CA的功能,但在相同催化条件下PtPAL不能催化L-酪氨酸生成对香豆酸。在不同pH（7.0-9.8）和不同温度（30-90℃）条件下测定PtPAL酶活性,结果显示PtPAL催化反应最适pH为9.0,最适温度为70℃。在最适条件下进行酶促反应动力学分析,结果表明PtPAL对L-苯丙氨酸具有较高的催化效率,PtPAL Km为0.89mM,Vmax为63.96 nkat·mg-1,Kcat为6.56 s-1,Kcat/Km为7.37×103 s-1·M-1。进一步探究金属离子对PtPAL酶活性的影响,结果表明Na+、K+、Ca2+对PtPAL催化活性的没有显著影响,Ba2+增强了PtPAL酶活性,Mn2+、Co2+、Cu2+及Zn2+抑制了PtPAL酶活性。3.半夏PtPAL基因启动子克隆和GUS组织化学染色根据PtPAL基因的编码区序列（CDS）设计引物,利用染色体步移（FPNI-PCR）技术,克隆得到长为1149 bp的PtPAL基因启动子序列。顺式作用元件分析表明PtPAL基因启动子序列含有TATA-box、CAAT-box等主要功能元件,也包含光响应（G-box、GT1-motif）、参与干旱胁迫（MBS）、水杨酸（TCA-element）和茉莉酸甲酯（CGTCA-motif）诱导等调控元件。将PtPAL基因启动子与GUS报告基因融合稳定转化拟南芥。转基因拟南芥GUS组织化学染色和GUS基因表达量分析表明,PtPAL基因启动子能够驱动GUS基因在拟南芥中表达,且在拟南芥幼苗的根和叶检测到GUS活性;随着幼苗的生长,在转基因拟南芥成熟组织花、茎、茎生叶、莲座叶和根中均有GUS基因表达。综上所述,PtPAL能够催化L-苯丙氨酸脱氨基生成反式肉桂酸,对L-苯丙氨酸有较高催化效率,且PtPAL基因能够拟南芥中根、叶、茎和花表达。PtPAL基因的克隆及功能鉴定为进一步探究半夏麻黄碱生物合成途径提供新的候选基因。