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背景及目的慢性前列腺炎是泌尿科最常见疾病之一,严重影响患者生活质量。慢性前列腺炎存在疗程长、易复发等问题,其主要原因是药物难以到达前列腺管腔内部,导致其难以发挥药效。Konstantin Charalabopoulos早在2001年就提出药物（如抗生素）能否穿透前列腺上皮屏障到达前列腺管腔内部发挥作用,取决于药物的脂溶性、离子化程度、蛋白结合力以及药物分子的大小或形状。绝大多数药物分子（如抗生素）呈弱酸性,穿透前列腺上皮屏障能力不佳（如头孢类抗生素）,导致治疗前列腺炎症疾病的候选药物品种少,治疗效果不佳。药物分子难以到达前列腺组织内部成为限制药物治疗前列腺炎的难点,国内外学者做了大量研究,但目前仍缺少有效措施。因此,亟需寻找一种新策略来提高药物分子对前列腺上皮屏障的穿透能力,并在前列腺炎症组织的微环境下进行特异性释放药物,提高药物分子在前列腺组织局部浓度,增加药物分子在前列腺管腔浓度,进而提高慢性前列腺炎的治愈率。纳米药物由于其特殊的靶向性能和药物缓控释能力,广泛用于疾病的诊断和治疗研究。纳米药物已被应用于肿瘤、炎症等多种疾病的治疗研究,包括前列腺癌治疗的临床研究,但尚未见纳米药物治疗前列腺炎症的研究报道。本项目拟通过纳米药物递送系统将药物靶向递送到前列腺炎症组织内部,并较系统的研究影响纳米药物靶向治疗慢性前列腺炎的制约因素,在细胞水平和动物模型上阐明纳米药物治疗慢性前列腺炎的效应机制。拟解决抗生素难以到达前列腺腔、慢性前列腺炎难于治疗的关键科学问题,为靶向治疗慢性前列腺炎提供一种新策略。实验方法1.空白纳米粒（Blank Oxi-αCD NPs）与负载头孢泊肟酯（Cefpodoxime proxetil,CPD）的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）响应性纳米药物的制备和表征。利用我们课题组前期所制备的ROS响应性材料（4-羟基苯硼酸频哪醇酯修饰的环糊精,Oxi-αCD）,用卵磷脂和DSPE-PEG作为稳定剂,采用纳米沉淀-自组装法制备空白纳米粒。通过粒度仪、透射电子显微镜（Transmission electron microscopy,TEM）来表征空白纳米粒的粒径大小、表面电位、聚合分散指数（Polymer dispersity index,PDI）和形态。另外,采用纳米沉淀-自组装法制备得负载CPD的ROS响应性纳米药物（CPD/Oxi-αCD NPs）和叶酸（Folic acid,FA）修饰的负载CPD的ROS响应性纳米药物（CPD/FA-Oxi-αCD NPs）,通过粒度仪、TEM表征其理化性质,并通过高效液相色谱法（High performance liquid chromatography,HPLC）测定其载药量及体外释药。2.纳米药物体外生物学评价及细胞靶向、体外抗炎机制研究。通过琼脂稀释法测定CPD、CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）。通过酶标仪测定CPD及其纳米药物对生物膜形成的影响。采用CCK-8试剂盒测定纳米药物对小鼠巨噬细胞RAW264.7和前列腺上皮细胞的细胞毒性。通过过氧化氢试剂盒测定RAW264.7和前列腺上皮细胞内外ROS变化。通过计数纳米药物治疗后的胞内细菌数目来测定纳米药物的胞内抑菌效果。采用Cy5标记的CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs考察纳米药物靶向RAW264.7和小鼠前列腺上皮细胞的能力。通过实时定量PCR（Real-time quantitative PCR,RT-q PCR）、蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测大肠杆菌感染后的RAW264.7和小鼠前列腺上皮细胞叶酸受体（Folate receptors,FRs）α和β表达情况,研究纳米药物靶向机制。通过RT-q PCR、酶联免疫吸附剂测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法测定CPD和纳米药物对大肠杆菌感染后的RAW264.7和前列腺上皮细胞以及细胞上清的炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-8的表达情况的影响。3.纳米药物体内生物分布、治疗效果和抗炎机制研究。采用Cy5标记的CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs对慢性前列腺小鼠给药后,在不同时间点进行活体成像考察纳米药物在慢性前列腺小鼠的体内生物分布情况。将不同给药时间点的小鼠前列腺组织进行冰冻切片,在激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscopy,CLSM）下观察纳米药物在前列腺组织内（包括前列腺管腔、腺腔和间质）的分布情况,观察纳米药物穿透前列腺上皮情况。通过RT-q PCR、WB和免疫组化检测慢性前列腺炎模型小鼠前列腺组织的FRα和FRβ表达情况,研究纳米药物的靶向机制。通过Von Frey纤维丝检测CPD及其纳米药物治疗慢性前列腺炎后小鼠的盆腔区域对痛觉反应情况。通过对前列腺组织进行苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,H＆E）和免疫组化来考察纳米药物治疗慢性前列腺炎后的病理变化和炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-8表达情况。通过RT-q PCR、ELISA、WB来检测血液和前列腺组织炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-8表达情况。通过检测给药后小鼠的血常规、肝肾功、脏器病理情况等指标来评价纳米药物的体内安全性。研究结果1.成功制备了负载CPD的ROS响应性纳米药物,粒度仪结果表明空白Oxi-αCD NPs、CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs的粒径分别为164±1 nm、172±1 nm和194±2 nm,TEM显示空白Oxi-αCD NPs、CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs均为球形结构,且大小均一。CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs的载药量分别为5.42±0.24%和4.33±0.10%。2.最小抑菌结果显示,纳米药物对E2429、E2519、E1809、E2949和E1969的最小抑菌浓度明显低于游离药物,证明纳米药物有较好的体外抑菌效果。琼脂稀释法检测出游离CPD、CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs对E2519的MIC分别为40μg/m L,10μg/m L,10μg/m L。1/8和1/16抑菌浓度的纳米药物较游离头孢泊肟酯明显抑制生物膜形成。CPD和CPD纳米药物均表现出较低的细胞毒性。ROS浓度测定结果表明ROS响应性纳米药物能显著降低RAW264.7和前列腺上皮细胞胞内外的ROS浓度。胞内抑菌结果表明CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs相对于CPD体现出更好的胞内抑菌效果。另外,CPD/FA-Oxi-αCD NPs较CPD/Oxi-αCD NPs胞内抑菌效果更佳。细胞吞噬实验证实CPD/FA-Oxi-αCD NPs能更有效地被RAW264.7和前列腺上皮细胞所吞噬。RT-q PCR、WB结果提示RAW264.7和前列腺上皮细胞感染后的FRα和FRβ表达明显上调。CPD/FA-Oxi-αCD NPs和CPD/Oxi-αCD NPs能显著降低感染后RAW264.7和前列腺上皮细胞的炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-8的表达,而CPD/FA-Oxi-αCD NPs效果更明显。3.活体成像结果表明CPD/FA-Oxi-αCD NPs比较CPD/Oxi-αCD NPs更多聚集于前列腺组织,CPD/FA-Oxi-αCD NPs更能穿透前列腺上皮层并聚集于前列腺腺腔。通过RT-q PCR、WB和免疫组化证实慢性前列腺炎模型小鼠前列腺组织的FRα和FRβ表达明显上调。Von Frey纤维丝检测提示在0.04 g、0.16 g、0.4 g刺激下CPD对慢性前列腺炎模型小鼠疼痛缓解不明显,而CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs治疗慢性前列腺炎模型小鼠后,小鼠疼痛反应明显减轻。通过H＆E染色明显观察到CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs较游离CPD更加能够减轻前列腺组织内炎症,并且CPD/FA-Oxi-αCD NPs较CPD/Oxi-αCD NPs组织内炎症减轻更加明显。通过RT-q PCR、WB、ELISA和免疫组化多个角度证实了CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs比较游离CPD更加能够降低血液和前列腺组织炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-8表达。最后,血常规、肝功及脏器病理情况等指标提示纳米药物体内安全性较好。结论1.成功制备了Blank Oxi-αCD NPs和负载CPD的ROS响应性纳米药物,纳米药物为球形结果,分布均一,粒径在150-200 nm之间,表面电位较低,各种理化性质结果表明纳米药物适合体内应用。2.体外药效实验证实CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs体外抑菌效果明显优于游离CPD,并且能够显著抑制细胞胞内外的ROS浓度。细胞实验证实CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs胞内抑菌和抗炎能力明显高于游离CPD。由于大肠杆菌感染的RAW264.7和前列腺上皮细胞FRα和FRβ过表达,通过FA介导的内吞作用,感染的RAW264.7和前列腺上皮细胞能内吞更多的CPD/FA-Oxi-αCD NPs,因而其胞内抑菌和抗炎效果均优于CPD/Oxi-αCD NPs。3.体内药效实验证实在慢性前列腺炎模型小鼠中,CPD/Oxi-αCD NPs和CPD/FA-Oxi-αCD NPs治疗效果明显优于游离CPD;FA修饰的CPD/Oxi-αCD NPs纳米药物由于FA介导的内吞作用而比非靶向纳米药物具有更高的组织靶向性,CPD/FA-Oxi-αCD NPs体内药效明显优于CPD/Oxi-αCD NPs。