【摘 要】
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背景:组织工程人工骨中骨髓间充质干细胞(BMSCs)、骨生长因子和合适的载体发挥重要作用。研究编码人骨形态发生蛋白2(hBMP2)和转化生长因子β 3(TGF-β3)的慢病毒(LV)对BMSCs
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背景:组织工程人工骨中骨髓间充质干细胞(BMSCs)、骨生长因子和合适的载体发挥重要作用。研究编码人骨形态发生蛋白2(hBMP2)和转化生长因子β 3(TGF-β3)的慢病毒(LV)对BMSCs的体内外成骨分化,促进骨形成,协同提高脊柱融合效果。方法:构建编码hBMP2和/或hTGF-β3基因的慢病毒并转染大鼠BMSCs。转染后BMSCs成骨分子的表达使用qRT-PCR和蛋白质印迹进行检测。构建大鼠腰椎后外侧横突间融合模型。术后通过放射学、手工触诊、Micro-CT和组织学进行评估融合效果。结果:hBMP2和/或hTGF-β3基因通过聚合酶链反应扩增,DNA测序,以及BLAST分析来确认。编码hBMP2和/或hTGF-β3基因的慢病毒感染的BMSCs可有效地过表达hBMP2和hTGF-β3,以及上调培养上清液中hBMP2和hTGF-β3的水平。共转染hBMP2和hTGF-β3比单独转染hBMP2或hTGF-β3更有效地诱导BMSCs成骨分化。LV-hBMP2和LV-hTGF-β3共转染组(分别编码hBMP2和hTGF-β 3的LV转染的BMSCs混合使用)和LV-hBMP2-hTGF-β3组(编码hBMP2和hTGF-β3融合基因的LV转染的BMSCs)中骨桥蛋白(OPN),骨钙蛋白(OCN)和骨保护素(OPG)的表达水平显著高于LV-BMP2(LV携带hBMP2转染的BMSCs)组和 LV-hTGF-β3(LV 携带 hTGF-β3 转染的 BMSCs)组(P<0.05)。hBMP2和/或hTGF-β3过表达上调碱性磷酸酶(ALP)活性。大鼠腰椎后外侧植入术后2周、4周、6周、8周通过放射学评估骨生长情况。大鼠腰椎后外侧植入术后8周,通过手工触诊、Micro-CT和组织学进行评估。LV-hBMP2和LV-hTGF-β3组1只(共5只),和LV-hBMP2-hTGF-β3组4只(共8只)大鼠脊柱全部融合;LV-空载体组6只(共7只),LV-hBMP2组1只(共8只)和LV-hTGF-β3组1只(共10只)大鼠脊柱全部植入处均未见明显骨痂生长;其余各组大鼠脊柱植入处可见部分骨痂,但是无法融合。结论:本研究表明慢病毒载体能够成功转导hBMP2和/或hTGF-β3基因,靶向基因可在BMSCs中成功过表达。我们的体外实验表明,联合使用hBMP2和hTGF-β3基因可以协同诱导骨分化。本实验条件下,慢病毒携带hBMP2和hTGF-β3基因感染的BMSCs,分别单独产生BMP2和hTGF-β3,在免疫活性大鼠模型中能诱导成骨,但是无法获得脊柱融合。hBMP2和hTGF-β3融合基因转染比hBMP2和hTGF-β3混合转染的BMSCs更能诱导成骨,脊柱融合率更高。免疫活性大鼠模型中,hBMP2和hTGF-β3基因可以联合使用、融合基因效果更佳,均能协同诱导成骨、促进脊柱融合,预计这两种细胞因子的组合将在未来作为一种治疗策略。
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