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目的:异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)是三羧酸循环的一个关键限速酶,功能是催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-KG)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)及二氧化碳,IDH1突变之后能直接催化α-酮戊二酸(α-KG)生成R-2-羟戊二酸(R-2-HG),R-2-HG能竞争性抑制组蛋白和DNA去甲基酶等多种α-KG依赖的双加氧酶活性,并可能促进肿瘤的发生发展。临床研究显示IDH1突变型患者比IDH1野生型患者对放化疗的反应更好,因此IDH1突变作为预后良好标志普遍存在于WHO Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤以及继发性胶质母细胞瘤中。但其中的机制尚不明了,本课题通过构建IDH1 R132H突变质粒,探究IDH1 R132H型突变对胶质瘤细胞的放射敏感性的影响及作用机制。方法:(1)首先通过双酶切带有GFP的GV230载体,后经PCR、连接、转化、质粒抽提等步骤得到IDH1 R132H质粒,将IDH1 R132H质粒和vector质粒转染胶质瘤细胞研究IDH1 R132H突变对胶质瘤细胞放射敏感性的影响。(2)CCK8细胞增殖实验检测IDH1 R132H型突变对胶质瘤细胞增殖活力的影响。细胞克隆实验检测空载组及IDH1 R132H组胶质瘤细胞在给予0、2、4、6、8 Gy照射后的细胞克隆形成能力。间接细胞免疫荧光检测vector组及IDH1 R132H组胶质瘤细胞在照射后核内γ-H2AX foci数目变化,观测IDH1 R132H对胶质瘤细胞的DNA双链断裂修复的影响,空载组及IDH1 R132H组细胞分别给予4 Gy照射后4 h及12 h收获细胞检测γ-H2AX foci。细胞周期实验检测IDH1 R132H对电离辐射引起的胶质瘤细胞周期进程的影响。(3)Western blot检测IDH1 R132H对TIGAR的表达含量的影响。最后通过ChIP检测IDH1 R132H突变下调TIGAR蛋白表达可能存在的机制。结果:(1)测序及western blot结果显示成功构建IDH1 R132H过表达质粒;(2)细胞增殖实验表明IDH1 R132H型突变降低胶质瘤细胞的增殖活力,克隆形成实验显示IDH1 R132H突变型组胶质瘤细胞的克隆存活分数显著低于vector组;(3)细胞免疫荧光实验显示IDH1突变延迟电γ-H2AX foci的消失,X射线照射后4 h突变组细胞的γ-H2AX foci数目较vector组多,12 h突变组细胞的foci数目仍然比vector组多,突变可延缓DNA损伤修复进程;(4)细胞周期实验表明IDH1 R132H突变细胞能够延迟电离辐射后引起的周期阻滞。Vector组及IDH1 R132H组胶质瘤细胞经4 Gy照射后12 h,IDH1 R132H组胶质瘤细胞的G2/M期阻滞细胞含量是vector组细胞的2倍;(5)Western blot实验结果显示IDH1 R132H突变下调TIGAR蛋白的表达,IDH1 R132H的特异性抑制剂AGI-5198处理后可逆转TIGAR下调;(6)Chip实验结果表明IDH1 R132H突变可上调TIGAR启动子区域组蛋白H3K9me3甲基化,进而抑制转录,下调TIGAR蛋白表达;IDH1R132H突变可降低胶质瘤细胞克隆形成能力,抑制胶质瘤细胞由X射线引起的DSB修复,增加G2/M期阻滞,抑制TIGAR蛋白表达,提高胶质瘤细胞的放射敏感性。结论:综上所述,IDH1 R132H突变型胶质瘤细胞较野生型细胞增殖活力低,克隆形成能力弱,抑制DSB修复,增加G2/M期的细胞阻滞。增加胶质瘤细胞的放射敏感性,有可能是通过增加TIGAR启动子区域的H3K9me3甲基化修饰抑制TIGAR蛋白来调控胶质瘤细胞的放射敏感性的。