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腹泻是导致仔猪死亡的常见传染性肠道疾病,对养猪业造成了极大的经济损失,已成为阻碍养猪业健康发展的绊脚石。C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C,C.perfringens type C)是引起仔猪细菌性腹泻的常见病原菌之一,该菌经消化道感染仔猪,在其肠道中大量繁殖,所产生的毒素破坏肠道组织并经体液循环系统运输而损害远端器官(如脾脏),从而引起仔猪腹泻及全身性器官的损伤。接种疫苗和使用抗生素可一定程度上减少并控制仔猪C型产气荚膜梭菌性腹泻的发生,但无抗和绿色健康养殖成为未来养殖业发展的方向之一,养殖过程中需尽可能减少药物对环境的污染以及猪只对疫苗和药物的依耐性。另外,脾脏lncRNA(long non-coding RNA)、mRNA和miRNA(microRNA)在大肠杆菌和沙门氏菌引起仔猪腹泻的过程中起重要调控功能,然而有关脾脏lncRNA、mRNA和miRNA在仔猪感染C型产气荚膜梭菌导致腹泻的调控机制研究较少。因此,从仔猪腹泻的调控机制着手,找出抵抗C型产气荚膜梭菌的相关分子,培育出抵抗C型产气荚膜梭菌的猪品系将成为防治仔猪腹泻的新途径。本研究选取30头7日龄仔猪为研究对象,随机选取5头仔猪作为对照组(SC),其余25头仔猪进行C型产气荚膜梭菌口服攻毒试验,根据腹泻总评分(由低到高)挑选前5头和后5头仔猪分别作为耐受组(SR)及易感组(SS),进一步利用RNA-Seq技术对SC、SR和SS三组仔猪脾脏组织进行测序及生物信息学分析,获得SC、SR和SS三组仔猪脾脏差异表达的lncRNA、mRNA和miRNA分子,并对这些差异表达分子进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,对重要的信号通路和关键分子进行系统研究,以期为揭示lncRNA、mRNA和miRNA在C型产气荚膜梭菌性腹泻过程中的调控机制提供参考。主要研究结果如下:(1)对拼接得到的184539条转录本进行后续筛选,在SC、SR和SS三组中共得到2056个新lncRNA(novel lncRNA),包括1811个基因间型lncRNA(large intergenic lncRNA,lincRNA)和245个反义型lncRNA(antisense_lncRNA),鉴定到了2144个已知lncRNA(annotated lncRNA)和4324个新mRNA(novel mRNA)。(2)鉴定出的新lncRNA与数据库ALDB中已知lncRNA具有非常相似的基因组特征,与已注释的蛋白编码基因相比较,这些新lncRNA具有更少的外显子数、较长的转录本、更短的开放阅读框、较低的表达量、更低的蛋白编码潜能和序列保守性不强等特点。(3)使用miRNA测序方法在15个脾脏样本中共获得338条已知miRNA成熟体(mature miRNA),对应295条miRNA前体(Pre-miRNA),得到514条新miRNA成熟体(novel mature miRNA),对应257条miRNA前体。(4)SC、SR和SS三组仔猪脾脏差异表达lncRNA、mRNA和miRNA的层次聚类图发现感染C型产气荚膜梭菌的SR和SS两组仔猪聚类在一起,说明两组的表达模式较为相近。(5)仔猪C型产气荚膜梭菌抗性和易感性个体间筛选出了19个差异表达lncRNA(上调9个和下调10个),基于cis和trans机制对这些差异表达lncRNA的靶基因进行了预测,cis机制预测出C型产气荚膜梭菌抗性和易感性仔猪个体间差异表达lncRNA上下游共存在23个靶基因,trans机制预测出93个与差异表达lncRNA存在显著相关性的靶基因;靶基因富集的GO功能主要有自然杀伤性T细胞的激活(NK T cell activation)、2型免疫反应的调控、(Regulation of type 2 immune response)、抵抗细菌(Defense response to bacterium)等,靶基因富集的KEGG信号通路主要包括自噬调控(Regulation of autophagy)、A型流感(Influenza A)、炎症性肠道疾病(Inflammatory bowel disease)等,差异表达lncRNA靶基因富集的这些GO功能和KEGG信号通路与C型产气荚膜梭菌性腹泻密切相关。(6)仔猪C型产气荚膜梭菌抗性和易感性个体间筛选出了123个差异表达mRNA(上调43个和下调80个),差异表达mRNA主要富集在与免疫应答、疾病相关的GO功能和KEGG信号通路,如GO功能有免疫系统生物学过程(Immune system process)、防御反应(Defense response)、先天性免疫应答(Innate immune response)、抵抗病毒(Response to virus);KEGG信号通路有阿米巴病(Amoebiasis)、A型流感(Influenza A)、荨麻疹(Measles)、军团杆菌病(Legionellosis)、细胞核因子酉乙蛋白(NF-kappa B)等,这些GO功能和KEGG信号通路可能与仔猪对C型产气荚膜梭菌的易感性和抗性有关。(7)仔猪C型产气荚膜梭菌抗性和易感性个体间筛选出了56个差异表达miRNA(上调21个和下调35个),这些miRNA靶基因主要富集在免疫T细胞增殖(Immature T cell proliferation)、防御应答调控(Regulation of defense response)等GO功能,这些差异表达miRNA可能调控靶基因在仔猪感染C型产气荚膜梭菌过程中起关键作用。(8)结合靶基因预测和功能分析,筛选出了2个与C型产气荚膜梭菌抗性相关的重要lncRNA,即ALDBSSCT0000006918和ALDBSSCT0000007366,均位于猪第3号染色体上,属于lincRNA类型,这两个lncRNA靶基因(如GADD45G、IL12A)富集的KEGG信号通路有丝裂原活化蛋白激酶(Mitogenactivated protein kinase,MAPK)、Toll样受体(Toll like receptor)等,说明SR与SS组间差异表达的ALDBSSCT0000006918和ALDBSSCT0000007366靶向调控其靶基因参与这些免疫信号通路来抵抗C型产气荚膜梭感染。(9)结合靶基因预测和功能分析,筛选出了4个与C型产气荚膜梭菌密切相关的关键miRNA,即miR-133b、miR-532-3p、miR-339-5p和miR-331-3p,其中SR组下调表达的miR-133b与上调表达的miR-532-3p能调控其靶基因NFATC4的表达水平,SS组上调表达的miR-339-5p和miR-331-3p能调控靶基因TNFAIP8L2的表达量,miR-339-5p靶向调控基因HTRA3的表达量,进而影响下游免疫基因和细胞因子基因的表达,这些腹泻抗性相关miRNA可能调控C型产气荚膜梭菌引起仔猪腹泻的免疫反应,是仔猪抵抗该病菌的关键靶点。总之,我们研究了C型产气荚膜梭菌抗性和易感性仔猪脾脏中差异表达lncRNA、mRNA及miRNA分子,经过生物信息学预测及功能分析,挖掘出了2个关键lncRNA(ALDBSSCT0000006918和ALDBSSCT0000007366)及4个重要miRNA(miR-133b、miR-532-3p、miR-339-5p和miR-331-3p),它们与抵抗C型产气荚膜梭菌感染仔猪的生物学过程密切相关,今后需在细胞水平进一步验证它们的具体调控机制,该研究为培育出抵抗C型产气荚膜梭菌的猪品系提供了一定的理论依据。