妊娠早期是奶牛妊娠建立和维持的关键时期,此阶段奶牛生理状态发生巨大变化,如生殖器官性能、内分泌调节、活动量以及发情状况等均会发货所能改变。阐明妊娠早期奶牛生理参数变化情况,从而全面了解奶牛妊娠早期这一生理阶段,可提高奶牛早期妊娠诊断准确率。乳外泌体miRNA可反映机体的生理状态,参与到奶牛广泛的生殖活动中,是良好的生物标志物,其变化可作为预测奶牛是否妊娠的重要依据。目前关于奶牛妊娠过程中外泌体miRNA的研究有很多,但是外泌体大都来源于血液、胎盘和输卵管等,且检测时间在人工授精21天以后,关于妊娠早期奶牛乳外泌体miRNA变化情况的研究未见报道。探究妊娠早期奶牛乳外泌体miRNA的变化情况,首先要获得大量纯度较高的牛乳外泌体,但是目前尚未有研究报道最适合牛奶来源外泌体的提取方法。因此本研究首先使用已建立的三种牛乳外泌体提取方法,包括凝乳酶提取法、等电点提取法和EDTA提取法,分别提取外泌体,然后通过对三种外泌体分别进行形态结构、粒径大小、表面特异蛋白表达等指标的比较,选择和优化一种牛奶源外泌体的提取方法。然后利用凝乳酶提取法,提取未妊娠（D0）和不同妊娠阶段（D10、D15、D20和D30）奶牛乳外泌体,每个时期三个生物学重复。利用高通量测序技术,分析妊娠不同时期奶牛乳外泌体miRNA的组成和分布情况,阐明妊娠早期奶牛乳外泌体miRNA的变化情况,寻找可能标志物,为奶牛妊娠早期生理研究和妊娠诊断生物标志物提供新途径和参考。试验得到以下结果:1.根据对凝乳酶提取法、等电点提取法和EDTA提取法所得外泌体鉴定指标判断,三种方法均可提取到牛乳外泌体,凝乳酶提取法可分离得到大量结构完整纯度较高的牛乳外泌体,更适合用于牛奶源外泌体的提取。2.基于高通量测序技术,本试验从不同妊娠阶段奶牛的15个乳外泌体miRNA组中共检测到2442种miRNA,其中335种为已知的miRNA,2107种为新发现的miRNA,在奶牛的30对染色体上均有分布,且在X染色体染色体上的分布量最广。3.韦恩图结果表明,共有18种miRNA在奶牛的5个不同的妊娠时期均有表达,bta-let-7a-5p、bta-let-7b、bta-mi R-30a-5p、bta-mi R-1307-R+1、bta-mi R-11987-L-1-1ss8TA只在奶牛妊娠时期表达。4.趋势分析结果表明,本试验从不同妊娠阶段奶牛的15个乳外泌体miRNA组,共呈现20种表达趋势,持续上升趋势为显著富集趋势,共包含41种miRNA,其中bta-mi R-30a-5p表达量高,变化倍数显著,且在妊娠阶段特异表达。从在不同妊娠时期具有显著持续上升趋势的的41种miRNAs挑选出11种表达量高,具有显著性差异,且相对于d-0天变化倍数大的miRNA,进行后期q RT-PCR验证,变化模式与RNA测序结果的表达模式相似,说明测序结果可靠。5.靶基因预测、GO和KEGG通路分析结果表示,在5个不同妊娠阶段具有显著持续上升趋势且表达量高,变化倍数大的miRNA主要富集在癌症信号途径、内吞作用、黏附斑激酶信号途径、MAPK信号通路、肌动蛋白骨架调节、c AMP信号通路、趋化因子信号通路、轴突引导等。上述结果表明:凝乳酶提取法更适合用于牛奶源外泌体的提取;妊娠早期奶牛乳外泌体miRNA的组成与含量均发生显著变化,bta-mi R-30a-5p可作为奶牛妊娠早期妊娠诊断的潜在生物标志物。