论文部分内容阅读
本文选用自组装葡聚糖-PLGA复合纳米粒(Dextran sulphate-PLGA hybrid nanoparticles, DPNs)作为口服药物传递系统,多功能纳米自组装体(Multifunctional nanoassembly, MNAs)作为静脉注射药物传递系统,以水溶性细胞毒性药物硫酸长春新碱(Vincristine sulfate, VCR)作为模型药物,考察了DPNs和MNAs的制剂学特征、体内药物动力学和组织分布特征,并研究了DPNs和MNAs克服肿瘤多药耐药性的作用与细胞摄取的机制。口服给药研究中,采用纳米沉淀和自组装结合的方法,引入反离子聚合物葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate, DS)与VCR产生静电相互作用,制备了一种新型的PLGA纳米粒DPNs。为了提高VCR的口服生物利用度,制备了VCR与P-gp抑制剂盐酸维拉帕米(Verapamil hydrochloride, VRP)共载药的多元DPNs,即VCR-VRP-DPNs,并对两种DPNs的制剂学特征进行了考察。两种DPNs均呈球形,且粒径分布比较均匀,平均粒径分别为128.3 nm和135.3 nm, Zeta电位分别为-13.8 mV和-14.1mV。当VCR与DS的电荷比为1：1时,正负电荷完全中和,VCR在两种DPNs中的包封率最高,分别可以达到93.6%和91.3%。采用动态透析法考察了DPNs的体外释放,结果表明VCR-DPNs和VCR-VRP-DPNs具有显著的缓释特征,96 h时VCR的累计释放量分别为80.4%和79.7%,无突释现象。VCR和VRP在VCR-VRP-DPNs中几乎能够达到同步释放。静脉注射给药研究中,引入反离子聚合物磷脂酰丝氨酸(PS)与VCR产生静电相互作用,制备了一种新型的PLGA纳米粒MNAs。为提高VCR的抗肿瘤活性和克服多药耐药性,制备了细胞毒性药物VCR、P-gp抑制剂VRP和Bcl-2抑制剂甘氨胆酸钠(GcNa)共同载药的多元MNAs,即VCR-VRP-GcNa-MNAs,并对两种MNAs的制剂学特征进行了考察。发现两种MNAs均呈球形,且粒径分布比较均匀,平均粒径分别为95.3 nm和99.3 nm,Zeta电位分别为-11.6 mV和-12.0 mV。当VCR与PS的电荷比为1：1时,正负电荷完全中和，两种MNAs的包封率最高,分别可以达到94.4%和93.8%。采用动态透析法考察了MNAs的体外释放,结果表明VCR-MNAs和VCR-VRP-GcNa-MNAs具有较好的缓释特征,96 h时VCR的累计释放量分别为83.2%和72.0%,无突释现象。VCR和VRP在VCR-VRP-GcNa-MNAs中几乎能够达到同步释放。建立了测定生物样品中VCR和VRP的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS),与文献报道方法相比,该方法具有选择性好,灵敏度高,分析速度快,血浆用量少的优势。研究了大鼠灌胃和静脉注射给予VCR溶液和纳米制剂后的体内药物动力学行为,结果表明,制得的纳米制剂与溶液对照组的主要药动学参数相比,药时曲线下面积显著增加,药物的消除半衰期显著延长。其中VCR-VRP-GcNa-MNAs和VCR-VRP-DPNs的效果与VCR-MNAs和VCR-DPNs相比更为显著。测定了小鼠静脉注射MNAs后血、心、肝、脾、肺、肾、脑各组织中的药物浓度,研究了MNAs制剂的组织分布特点。与溶液对照组相比,MNAs制剂显著改变了药物的体内组织分布特点。两组MNAs制剂在心、肺、肾中的组织药物浓度显著低于溶液对照组,而血浆药物浓度均显著高于溶液对照组。采用MTT法检测了VCR的8种不同制剂对人乳腺癌敏感细胞MCF-7和耐药细胞MCF-7/Adr中的细胞毒性,通过比较制剂的IC50值、耐药指数RI和逆转耐药因子RF,考察了VCR单独载药制剂VCR-DPNs和VCR-MNAs, VCR与P-gp抑制剂VRP共载药制剂VCR-VRP-DPNs,以及VCR、VRP和Bcl-2抑制剂GcNa共载药制剂克服肿瘤多药耐药性的作用。结果表明,单独载药制剂VCR-DPNs和VCR-MNAs具有部分克服多药耐药性的作用,而共载药制剂VCR-VRP-DPNs和VCR-VRP-GcNa-MNAs中的多组分能够产生协同的抗肿瘤活性,可以逆转MCF-7/Adr对VCR的多药耐药性。为了探讨DPNs和MNAs克服多药耐药性的作用与机制,进行了细胞摄取及摄取机制的研究。细胞摄取实验表明DPNs和MNAs显著提高VCR在耐药细胞的蓄积量,而且多元共载药方案提高摄取的作用最强。低温和内吞抑制剂(叠氮钠和氯丙嗪)均显著降低DPNs和MNAs在MCF-7/Adr细胞内的摄取率,而吲哚美辛显著只降低了MNAs的摄取,对DPNs的摄取没有影响，说明耐药细胞摄取DPNs和MNAs的过程为能量依赖性的内吞方式,且摄取过程可能存在clathrin介导的内吞途径,而MNAs的摄取可能还存在caveolae介导的内吞途径。这一内吞方式避免了P-gp介导的VCR的外排,使VCR在耐药细胞蓄积量增加，从而克服了肿瘤细胞的多药耐药性。