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研究背景：吗啡在临床上是一种有效且应用广泛的止痛剂,但是患者长时间使用吗啡镇痛会产生一种对吗啡耐受的药理现象,即等量的药物缓解疼痛的时间越来越短、镇痛效果也越来越差,必须不断加大剂量才能缓解疼痛,但是加大吗啡用量的同时又带来了恶心、呕吐、便秘等副作用。尽管已经有研究发现吗啡耐受的众多因素,但是吗啡耐受的机制仍是医学疼痛领域的一大挑战性课题。有大量的研究发现吗啡耐受和神经病理性疼痛有许多共同的发生机制,近来人们在神经病理性疼痛领域关于表观遗传学机制的研究给我们探索吗啡耐受的发生发展机制提供了非常重要的信息。表观遗传调控主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰(磷酸化、甲基化和乙酰化)和小RNA调节。而其中的组蛋白乙酰化修饰是指由组蛋白乙酰转移酶(histone acetylase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)对核心组蛋白N端特定的赖氨酸(lysine,Lys)残基进行乙酰化和去乙酰化,调控基因的转录。关于吗啡耐受的表观遗传学机制的相关研究较少,本课题的完成将为吗啡耐受的机制研究提供新的信息和线索,为克服吗啡耐受这个医学难题提供新的思路和方向。研究目的：观察吗啡耐受大鼠吗啡的镇痛效应变化,同时检测脊髓腰膨大中总体乙酰化组蛋白H3(Acetyl-Histone H3,Ac-H3)和第Ⅲ类经典去组蛋白乙酰化酶SIRT1(Sirtuin type1)表达的动态变化,探索组蛋白去乙酰化酶SIRT1在慢性吗啡耐受的发生发展中的潜在作用；采用SIRT1的激动剂白藜芦醇鞘内注射,上调SIRT1的表达,观察其对慢性吗啡耐受大鼠疼痛行为学的影响,并检测各组脊髓腰膨大总体Ac-H3、Ac-H3、SIRT1、NR2B的表达变化,探索慢性吗啡耐受的组蛋白乙酰化的调控机制,为慢性吗啡耐受的治疗提供理论探索。研究方法：1.将成年雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠(体重280-320g)随机分为生理盐水组(normal saline, NS组)、吗啡耐受I组(morphine tolerance,MT I组)和吗啡耐受Ⅱ组(MT Ⅱ组)。测量全部大鼠机械痛阈和热痛阈基础值后,按改良Yaksh法对大鼠进行鞘内置管,在实验期间(13天)吗啡耐受Ⅰ组连续6天每天两次鞘内注射吗啡(10μg)形成吗啡耐受后从第7天开始改为每天鞘内注射一次吗啡(10μg)一次等容积的生理盐水注射；吗啡耐受Ⅱ组持续每日(13天)鞘内注射两次吗啡(10μg)；生理盐水组则注射相同容积的生理盐水代替吗啡Ⅱ组的吗啡注射。分别于术后的第1、3、5、7、9、11、13天测定大鼠的机械痛阈和热痛阈,根据机械痛阈和热痛阂的变化,选择适合研究吗啡耐受逆转的吗啡耐受模型进行下一步的实验研究。2.将成功鞘内置管的SD成年雄性大鼠随机分为2组即生理盐水组(normal saline, NS组)、吗啡耐受组(morphine tolerance,MT组)。测量两组大鼠机械痛阈和热痛阈基础值后,吗啡耐受组按第一步选择出来的吗啡耐受模型进行吗啡注射；生理盐水组则注射相同容积的生理盐水代替吗啡耐受组的吗啡注射。分别于术后的第1、3、5、7、9、11、13天测定大鼠的机械痛阈和热痛阈,并在相应的时间点取大鼠脊髓腰膨大组织实时荧光定量逆转录聚合酶反应(quantificational reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)技术检测第Ⅲ类去乙酰化酶SIRT1mRNA,采用免疫印迹(western blot, WB)技术检测SIRT1、Ac-H3、Ac-H4(Acetyl-HistoneH4)的表达变化。3.将已经成功置管的SD成年雄性大鼠随机分为7组,分别为生理盐水组(NS组)、吗啡耐受组(MT组)、白藜芦醇组(Resveratrol, RES15μg组、ZES30μg组、RES60μg组和RES300μg组)和溶媒组(dimethyl sulfoxide, DMSO组)。测量各组大鼠的基础痛阈后,生理盐水组持续每天两次鞘内注射生理盐水10山,而其他6组持续每天两次鞘内注射吗啡10μg形成吗啡耐受后,从第7天起在两次吗啡注射之间鞘内注射白藜芦醇(15μg、30μg、60μg、300μ)和DMSO。分别在术后的第1、3、5、7、9、11、13天测量各组大鼠热痛阈、机械痛阈,观察在吗啡耐受后持续鞘内注射不同剂量的白藜芦醇对吗啡的镇痛效应的影响,选取可以逆转吗啡耐受最小有效剂量进行后续试验。4.将成功置管的SD成年雄性大鼠(体重280-320g)随机分为4组,分别为生理盐水组(NS组)、吗啡耐受组(MT组)、溶媒组(DMSO组)、白藜芦醇组(Res组)。测量各组大鼠的基础痛阈后。NS组整个实验期间(13天)每日两次鞘内注射生理盐水10山,而MT、DMSO和RES组持续每天两次鞘内注射吗啡10μg,待大鼠都形成了慢性吗啡耐受后,继续予以原剂量吗啡维持吗啡耐受状态并从第7天开始分别鞘内注射生理盐水、DMSO和最小有效剂量白藜芦醇至第13天。期间测量各组大鼠术后的第1、3、5、7、9、11、13天热痛阈、机械痛阈。第13天完成行为学测试后将大鼠深麻醉状态下处死,取其脊髓腰膨大采用免疫组织化学检测各组大鼠脊髓背角SIRT1阳性细胞数的变化；采用qRT-PCR检测各组大鼠脊髓腰膨大组织SIRT1mRAN、NR2BmRAN表达变化；免疫印迹(western blot,WB)方法检测各组大鼠脊髓腰膨大总体Ac-H3、SIRT1和NR2B蛋白水平表达变化。研究结果：1.生理盐水组(NS组)、吗啡耐受组(MT Ⅰ组)和吗啡耐受组(MT Ⅱ组)大鼠的基础痛阈无明显差异(P>0.05)在整个实验期间,NS组的机械痛阈和热痛阈和基础痛阈相比均无明显差异(P>0.05)。MT Ⅰ组和MT Ⅱ组在吗啡鞘内注射后的第1、3天,大鼠的机械痛阈和热痛阈与基础痛阈对比明显升高(P<0.05),吗啡的镇痛效应较强。到第7天,吗啡的镇痛效应完全消失,机械痛阈和热痛阈与基础痛阈相比无明显差异(P>0.05)；之后MTⅡ组大鼠的吗啡耐受状态持续至第13天,而MT1组大鼠的吗啡耐受状态慢慢减轻,至第13天,吗啡的镇痛效应明显恢复。2.生理盐水组(NS组)、吗啡耐受组(MT组)大鼠的基础痛阈无明显差异(P>0.05)。在整个实验期间,NS组的机械痛阈和热痛阈和基础痛阈相比均无明显差异.(P>0.05)。吗啡耐受组大鼠在第7天已经产生了彻底的吗啡耐受,并持续至第13天。在各个时间点取两组大鼠脊髓腰膨大组织进行qRT-PCR分析,发现与生理盐水组相比,吗啡耐受组大鼠脊髓腰膨大组织SIRT1mRNA表达从第5天开始明显下降,并持续至第13天；WB分析结果显示与生理盐水组大鼠相比,也是在第5天,吗啡耐受组大鼠脊髓腰膨大组织总体Ac-H3蛋白水平出现明显升高、SIRT1蛋白表达明显下降,持续到第13天,差异有统计学意义(P<0.05),而在整个实验过程中总体Ac-H4蛋白表达无明显差异(P>0.05)。3. NS组、MT组、Res15μg组、Res30μg组、Res60μg组、Res300μg组和DMSO组大鼠术前基础机械痛阈和热痛阈值无明显差异(P>0.05)。在第7-13天,NS组、MT组和DMSO组机械痛阈和热痛阈与基础痛阈值相比无明显差异(P>0.05)；第9天时Res30μg组、Res60μg组和Res300μg组的吗啡镇痛效应开始明显恢复,持续到第13天,热痛阈、机械痛阈与基础痛阈相比有显著性差异(P<0.05),而Res15μg组吗啡的镇痛效应并不能恢复,大鼠热痛阈、机械痛阈与基础痛阈比较无明显差异(P>0.05)。与Res30μg组相比,Res60μg组和Res300μg组的吗啡镇痛效应差异无统计学意义(P>0.05)。4.与DMSO组大鼠比较,第7-13天吗啡耐受大鼠鞘内注射白藜芦醇后机械痛阈和热痛阈明显升高,吗啡耐受明显逆转(P<0.05)；NS组、MT组、Res组和DMSO组第13天大鼠脊髓腰膨大处的免疫组化显示,SIRT1主要在脊髓背角浅层Ⅰ-Ⅲ层致密表达,阳性颗粒主要表达在细胞核,胞浆可见少量表达。吗啡耐受大鼠的脊髓背角浅层SIRT1阳性细胞数较NS组明显减少,但是经过白藜芦醇干预后的吗啡耐受大鼠的脊髓背角处的SIRT1阳性细胞数较MT组明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR的结果显示,较MT组比较,Res组大鼠脊髓腰膨大中的NR2BmRNA表达明显下降,而SIRT1mRNA表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)；WB结果显示, Res组大鼠脊髓腰膨大处的SIRT1蛋白水平的变化和qRT-PCR的结果一致；MT组NR2B和Ac-H3的蛋白水平变化和NS组相比较明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；和MT组大鼠相比,白藜芦醇干预后的Res组大鼠脊髓NR2B和Ac-H3的蛋白水平则出现明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。研究结论：1.连续6天每天两次鞘内注射吗啡10μg形成的吗啡耐受状态需要继续原剂量的吗啡注射才能维持,吗啡持续耐受状态下研究吗啡耐受逆转机制更有意义。2.脊髓腰膨大处总体Ac-H3和SIRT1在术后第7天即吗啡耐受形成的时间点出现了明显的下调,而在之后的吗啡耐受状态下一直处于低表达状态。和吗啡耐受大鼠行为学变化相同步。提示大鼠脊髓腰膨大处总体H3的乙酰化水平和去乙酰化酶SIRT1异常表达很可能在吗啡耐受的形成机制中起着重要的作用。3.30μg白藜芦醇持续鞘内注射可以明显逆转吗啡耐受但是白藜芦醇(≥30μg)的逆转吗啡效应无剂量依赖性。4.白藜芦醇上调SIRT1表达的同时也影响了脊髓总体Ac-H3和NR2B受体的表达。提示白藜芦醇的逆转吗啡耐受效应很可能是通过依赖SIRT1组蛋白去乙酰化酶的功能来调节NR2B基因表达的。