研究背景与目的: 霍乱是一种由霍乱弧菌引起的烈性传染病，致剧烈腹泻并能快速传播。世界第七次大流行自1961年延续至今，波及世界五大洲100多个国家，尚未得到有效控制。根据O抗原，霍乱弧菌分为200多个血清群，能引起霍乱的有O1群的古典型霍乱弧菌、El Tor型霍乱弧菌及O139群霍乱弧菌。霍乱第六次大流行延续到1961年，是由古典型霍乱弧菌引起的，而第七次大流行是由El Tor型霍乱弧菌引起的。O139血清型霍乱弧菌，是自1992年从印度半岛开始流行的一种新型霍乱，且O139群与O1群疫苗的交叉保护力低。有证据表明O139群霍乱弧菌起源于El Tor型霍乱弧菌，从非O1群霍乱弧菌中获得O139表型，因此O139群霍乱弧菌获得了O1群的毒力和非O1群霍乱弧菌的荚膜。 霍乱弧菌主要致病因子是霍乱毒素（CT），由CTX元件中的ctxAB基因编码，受环境信号影响和调节。CTX遗传元件来自CTXФ噬菌体，很有可能可以在环境中的霍乱弧菌间传递。CTXФ是一个约6．9kb大小的单股丝状噬菌体，有两个部分组成：2．4kb的RS2序列和4．5kb的核心区。RS2是调节序列，从5’端到3’端为rstR，rstA和rstB，其中rstR编码一抑制蛋白rstR，介导了CTXФ的噬菌体免疫。而核心区有六个基因，包括ctxAB操纵子。霍乱毒素由5个受体结合B亚单位围绕1个毒性A亚单位组成，作用于小肠，与神经节苷脂GM1结合后通过增强腺苷酸环化酶活性而提高肠道内环磷酸腺苷（cAMP）水平，并将氯化物和碳酸氢盐分泌到小肠，导致水分从机体血管内和细胞外间隙排出，迅速进入肠腔，从而造成严重腹泻。 基因敲除技术从20世纪80年代末开始发展，在生命科学领域有广泛应用前景。同源重组是基因敲除的方法之一，而自杀质粒是一种通过同源重组技术来构建无痕缺失突变株的有效载体，其利用目标基因两端的同源片段，精确定位自杀质粒的整合位点。采用“上游片断-插入基因-下游片断”方式缺失的菌株能够避免极性效应，并使靶基因完全失活。 随着对肠道黏膜免疫重要性的认识以及霍乱弧菌分子生物学研究的深入和基因重组技术的发展，霍乱疫苗的研究逐步倾向于通过基因工程方法缺失霍乱毒素及其他毒力相关基因的减毒活疫苗研制，如O1群减毒活疫苗的CVD103-HgR，Peru-15和V． cholerae638以及O139群霍乱弧菌减毒活疫苗的Bengal-15和CVD112等。这些疫苗能激发机体产生类似天然霍乱感染后的免疫反应，但也存在一些副反应，及可能通过噬菌体感染获得毒力基因如CTXФ而使毒力回复。 本研究以O139群霍乱弧菌ZJ199693为出发株，通过基因重组技术缺失其染色体上的主要毒力基因簇TLC、CTX和RTX，并插入rstR和ctxB基因，再进一步缺失溶血素编码基因hlyA，同时插入筛选标记绿色荧光蛋白编码基因GFPuv，构建O139群霍乱弧菌减毒活疫苗候选株。我们的目的是缺失O139群霍乱弧菌的主要毒力基因并尽量减少疫苗候选株的副反应及毒力回复可能，并通过绿色荧光蛋白的整合使疫苗候选株与野生菌株在环境中易于区分。 其中，TLC因子功能与CTXФ获得与复制有关，CTX基因簇主要携带了编码霍乱毒素CT的ctxAB基因和CTXФ整合的attB位点，而RTX毒素与Hep-2细胞毒性有关，使哺乳动物细胞肌动蛋白交联而致细胞圆缩。霍乱弧菌的溶血素（HlyA）是一个分子量为65000的水溶性孔形成毒素，由hlyA编码。RTX毒素及溶血素均能引起小鼠肠道感染，都是引起霍乱弧菌减毒活疫苗反应原性的主要因子。把TLC、CTX、RTX基因簇及hlyA基因缺失后我们能大大降低霍乱弧菌毒性及毒力回复的可能性。并且，由于rstR基因编码的产物能够抑制同型噬菌体对霍乱弧菌的再转染，插入rstR基因能进一步降低疫苗候选株重获毒力的可能性，提高其生物安全性，而ctxB基因编码的霍乱毒素B亚单位能赋予机体针对疫苗的抗毒免疫能力。绿色荧光蛋白（GFP）来自维多利亚水母发光蛋白，在波长为395-498nm的紫外线激发下发光。重组绿色荧光蛋白（GFPuv）基因在质粒pGFP上，由大肠杆菌表达。GFPuv由野生GFP经点突变而来，氨基酸位置Ser取代Phe99，Thr取代Met153，Ala取代Val163。GFPuv在大肠杆菌中比野生GFP表达快，所发荧光比野生GFP亮，紫外线激发波长为360～400nm。GFPuv，大小为27道尔顿，是由238个氨基酸组成的球状蛋白质，在pH5．5-11．5稳定，最佳pH为8．0。绿色荧光蛋白整合进疫苗候选株染色体后，菌体在360～400nm紫外激发下发绿色荧光，从而有利于在环境中检测疫苗候选株。 研究方法: 1．引物设计根据GenBank上公布的O1群El Tor型霍乱弧菌国际标准株N16961及pGFPuv全序列设计引物。 2．串联霍乱弧菌主要毒力基因簇上下游片段及氯霉素抗性基因自杀质粒的构建PCR扩增霍乱弧菌主要毒力基因簇TLC-CTX-RTX的TLC上游片段（TLCu p）、RTX下游片段（RTXdown），克隆入pU18中，再在两者间插入氯霉素抗性（cat）基因，获得重组质粒pUC18-TLCup-cat-RTXdown。酶切回收TLCup-cat-RTXdown片段，克隆入自杀质粒pDS132，构建重组自杀质粒pDS132-TLCup-cat-RTXdown。 3．霍乱弧菌主要毒力基因簇TLC-CTX-RTX缺失株9693-1的筛选通过接合将重组自杀质粒pDS132-TLCup-cat-RTXdown转入O139群霍乱弧菌ZJ199693，20%蔗糖选择培养基（氯霉素抗性）筛选TLC、CTX、RTX基因缺失株，然后再通过PCR、测序验证。 4．串联霍乱弧菌主要毒力基因簇上下游片段、rstR和ctxB基因自杀质粒的构建PCR扩增霍乱弧菌主要毒力基因簇TLC-CTX-RTX的TLC上游片段（TLCup）、RTX下游片段（RTXdown），克隆入pU18中，再在两者间插入rstR和ctxB基因，获得重组质粒pUC18-TLCup-rstR-ctxB-RTXdown。酶切回收TLCup-rstR-ctxB-RTXdown片段，克隆入自杀质粒pCVD442，构建重组自杀质粒pCVD442-TLCup-rstR-ctxB-RTXdown。 5．疫苗候选株O139-45的筛选及鉴定通过接合将重组自杀质粒pCVD442-TLCup-rstR-ctxB-RTXdown转入TLC、CTX、RTX基因缺失株，20%蔗糖选择培养基筛选cat基因被rstR和ctxB基因替换了的重组改造菌株，然后再通过PCR、测序验证。 6．兔肠段结扎试验测CT毒性ctxAB基因编码霍乱肠毒素CT，是引起霍乱的最主要因子。将霍乱弧菌注射入结扎了的兔肠段中，通过第二天观察肠段是否有充血、积液而判定该霍乱弧菌是否产毒。 7．Hep-2细胞毒性试验测RTX毒素RTX毒素能使Hep-2细胞肌动蛋白交联而致细胞圆缩，因此我们通过Hep-2细胞毒性试验检测度毒力基因缺失株的细胞毒性是否消失。 8．GM1-ELISA测CTB蛋白CT毒素B亚单位（CTB）能与神经节苷脂GM1特异性结合，因此我们用GM1-ELISA检测重获ctxB基因的重组菌株的CTB表达情况。 9．串联溶血素上下游及绿色荧光蛋白基因的自杀质粒的构建PCR扩增溶血素hlyA基因上游片段（hlyAup）、hlyA下游片段（hlyAdown），克隆入pU18中，再在两者间插入lacz-GFPuv基因，获得重组质粒pUC18-hlyAup-laczGFPuv-hlyAdown。PCR扩增hlyAup-laczGFPuv-hlyAdown片段并将其酶切克隆入自杀质粒pCVD442，构建重组自杀质粒pCVD442-hlyAup-laczGFPuv-hlyAdown。 结论: 1．O139群霍乱弧菌基因工程减毒活疫苗候选株的构建构建了出发株ZJ199693染色体上毒力相关基因簇TLC、CTX、RTX被保护性基因rstR及抗原基因ctxB替换的重组改造菌株O139-45，可作为疫苗候选株作进一步的免疫效果考核。 2． O139群霍乱弧菌基因工程减毒活疫苗候选株的初步评价家兔小肠肠段结扎测毒试验显示缺失株9693-1和疫苗候选株O139-45明显减毒，9693-1和O139-45的最主要毒力基因ctxAB被缺失。Hep-2细胞毒性试验显示缺失株9693-1对Hep-2细胞毒性作用消失。GM1-ELISA显示O139群霍乱弧菌减毒活疫苗候选株O139-45的ctxB基因表达良好。 3．串联溶血素上下游及绿色荧光蛋白基因的自杀质粒构建构建了绿色荧光蛋白表达良好的重组自杀质粒pCVD442-hlyAup-laczGFPuv-hlyAdown，可用于进一步对疫苗候选株O139-45进行基因重组，缺失溶血素编码基因hlyA并插入筛选标记绿色荧光蛋白编码基因GFPuv，这样可使139群霍乱弧菌减毒活疫苗候选株的残余毒力更小，且通过长波紫外照射就能观察到疫苗候选株发绿色荧光，从而有利于在环境中检测疫苗候选株及后续研究。