目的:　　C3d 是 C3 分子不能再被蛋白酶水解的最小片段，始终与抗原共价结合。C3d作为一种天然的免疫佐剂分子，可通过特异性补体受体2（CR2/CD21）将抗原信号提供给免疫细胞，增强机体的免疫应答。链亲和素同型四聚体对生物素（也称为维生素 B7 或维生素 H）具有非常高的亲和力。借助于生物素与链亲和素之间强大的非共价作用力，利用细胞膜表面蛋白质的伯氨（即-NH2）易于生物素化，就可以将带有链亲和素的特定的具有免疫效应的蛋白锚定在生物素化的细胞表面。制备SA-C3d融合蛋白，就可以利用生物素-链亲和素系统的细胞膜表面修饰技术，在分子佐剂与肿瘤疫苗方面得到广泛的应用。融合蛋白的体外功能探索，也为更长远的动物体内功能实验提供理论支撑。　　方法:　　1、融合蛋白表达质粒pET24a-6HIS-SA-C3d的构建　　利用实验室保存的质粒pET24a-6HIS-SA-IL15，利用限制性内切酶将IL-15段切除。以C3 cDNA为模板，设计引物，扩增出C3d段，使用一步克隆法，将C3d段与酶切后切胶回收的基础质粒连接。通过菌液PCR与限制性内切酶对已构质粒进行鉴定，将鉴定正确的质粒送测序，最终筛选测序正确的尝试诱导目的蛋白。　　2、融合蛋白SA-C3d的诱导表达、纯化复性与鉴定　　选择测序正确的质粒转入表达感受态Rosseta中，先采用常规诱导条件测试是否能成功诱导出目的蛋白。选出能诱导蛋白的克隆进行小规模（5ml LB培养基）优化诱导条件，包括诱导时间与诱导剂浓度。确定诱导条件后，采用2L摇瓶诱导目的蛋白。表达在上清中的目的蛋白通过镍柱分离纯化，再用PBS透析过夜即可，而表达在包涵体中的目的蛋白，需将包涵体洗涤后，溶解在8M脲素溶液中，再通过镍柱分离纯化，最后采用透析复性的方法帮助蛋白正确折叠。用SDS-PAGE和WB的方法对蛋白进行鉴定。　　3、融合蛋白SA-C3d体外功能探索　　使用生物素化试剂TFP-esters将贴壁生长的膀胱癌细胞系MB49细胞生物素化后，用流式细胞术分别检测表达于上清的 SA-C3d 与包涵体复性后的 SA-C3d对MB49细胞的结合率，以此反映融合蛋白SA的功能。将SA-C3d与CR2阳性的Raji细胞共培养，用CCK-8检测含有SA-C3d的培养基组与不含有SA-C3d的培养基组Raji细胞的增殖，来探究融合蛋白C3d的功能。　　结果:　　1、成功构建SA-C3d融合蛋白表达质粒　　将实验室保存质粒pET24a-6HIS-SA-IL15通过限制性内切酶BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切切除IL-15段，将PCR扩增而来的C3d段与酶切后线性化质粒相连，选出菌液PCR与酶切鉴定正确的5号克隆送测序，测序结果符合预期。　　2、SA-C3d融合蛋白的诱导表达、纯化、复性与功能鉴定　　将表达质粒转入感受态Rosseta中，首先使用常规诱导条件（37℃，1mMIPTG ，诱导 5h）能成功将目的蛋白诱导出来，再使用 5mlLB 小规模摇菌，优化诱导条件，发现在37℃时，蛋白诱导6h ，诱导剂IPTG浓度为0.5mM的条件为最优。目的蛋白SA-C3d在包涵体与上清中都有表达。将包涵体洗涤后，目的蛋白约占菌体总蛋白的67%作用。用软件ExPASy计算出融合蛋白的等电点为5.6，故将纯化与复性相关的溶液的PH都调为8.0。将包涵体用8M脲素过夜溶解后，使用镍柱进行分离纯化后，目的蛋白洗脱峰高且尖，取纯度较高的洗脱峰下降段用于后续蛋白的复性。经透析复性后目的蛋白的纯度达到90%以上，且以四聚体或更大聚体的形式存在。而复性后表达与上清中的蛋白则存在二聚体、三聚体与四聚体。　　3、融合蛋白SA-C3d的体外功能探索　　用流式细胞术检测0.1ug、1ug、10ug的包涵体复性后的SA-C3d与表达在上清中的SA-C3d与0.1M生物素化的MB49细胞的结合率，当包涵体复性蛋白用量为 0.1ug 时，与细胞的结合率已达到 80%以上，其后，随着蛋白用量的增加，与细胞的结合率也增加。而表达与上清中的SA-C3d，当蛋白用量为10ug时，才显示与细胞明显的结合（80%），当蛋白用量较低时，与生物素化细胞的结合率很低，分别为13.8%、 19.8%。使用10ug/ml、30ug/ml、 90ug/ml 、120ug/ml的SA-C3d与CR2阳性的Raji细胞共培养，发现与不加SA-C3d的RPMI-1640全培组相比，融合蛋白促进Raji细胞的增殖，且呈现剂量依赖效应。　　结论:　　本实验通过大肠杆菌原核表达系统表达目的蛋白SA-C3d，具有遗传背景简单，成本低廉，产量高等优点。通过在SA-C3d诱导表达中条件的摸索，确立了蛋白表达的最优条件。使用降低变性剂（脲素）浓度梯度的透析复性的方法，解决了融合蛋白大量表达在包涵体中而没有生物活性这一难题。使用流式细胞术检测融合蛋白与生物素化MB49细胞的结合率以及使用CCK-8探索SA-C3d促进CR2阳性B细胞系的增殖实验，体现蛋白SA-C3d具有双功能活性。这些前期的实验探索为此后的体内功能实验以及更为广阔的分子佐剂与肿瘤疫苗方面的应用奠定了坚实的基础。