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目的:核酸疫苗是90年代从基因治疗研究领域发展起来的一种新的免疫技术。它可诱导机体产生包括体液免疫应答和细胞免疫应答在内的全面的免疫应答,与传统疫苗相比有许多全新的潜在优势,从而被誉为第三次疫苗革命。目前对于核酸疫苗的研究,主要涉及包括病毒、细菌和原虫在内的多种传染性病原的预防。但由于其抗原分子小、纯化程度高,疫苗的免疫原性不够理想。因此需要安全有效的佐剂来增强疫苗的效力。有效的免疫佐剂对DNA疫苗的免疫保护作用及发挥长效免疫效果有增强作用。CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)中的CpG基序能够刺激B细胞,T细胞,自然杀伤细胞和抗原提呈细胞发生免疫级联放大反应。CpG-ODN可以诱发机体产生Th1型免疫反应并能诱导致炎因子的产生。在体内,骨髓来源的免疫细胞包括单核细胞,巨噬细胞和骨髓来源的树突细胞均表达TLR9受体,TLR9受体对CpG基序作出反应。溴化二甲基双十八铵(DDA)是一种阳离子脂质,作为一种佐剂它可以吸附抗原到它的表面,能增强IFN-γ的分泌和诱发免疫保护反应,并能增强抗原在体内诱导的体液和细胞免疫反应。DDA的作用类似于微胶囊,缓慢释放包裹的质粒载体,从而达到长时间表达抗原的作用,因此在机体抵抗多种疾病中发挥重要作用。Lipofectamine TM 2000是一种阳离子聚合物,带净正电荷的聚合物与带负电荷的DNA之间相互作用,自发形成了脂质-DNA复合物。脂质体-DNA复合物能与细胞表膜和细胞内膜直接融合或通过内吞作用进入细胞。脂质扩散入靶细胞膜的过程,破坏了膜与DNA间的相互作用,从而使DNA进入细胞浆。作为佐剂Lipofectamine TM 2000可以诱导机体产生Th1反应,已被广泛应用于增强DNA疫苗免疫效果的研究。本室构建的犬传染性肝炎病毒核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop免疫小鼠诱导了体液免疫和细胞免疫的产生。为进一步提高pVAX1-CpG-Loop免疫效果,寻求最佳适配佐剂,本次实验是在本室对核酸疫苗pVAX1-CpG-Loop的研究基础上,用佐剂CpG-ODN,DDA和Lipofectamine TM 2000与质粒pVAX1-CpG-Loop共同免疫小鼠,并检测其诱导小鼠产生的细胞及体液免疫效果。方法:1质粒的大量提取采用SDS-碱裂解法大量提取重组质粒pVAX1–CpG -Loop,采用聚乙二醇沉淀法纯化质粒。并对提取的重组质粒pVAX1-CpG-Loop经分光光度计进行纯度和浓度测定。将原核表达质粒pET28a(+)Loop转化大肠杆菌BL21(DE3),摇菌并诱导重组Loop蛋白的表达, Western blot鉴定。用尿素溶解沉淀,采用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,透析并复性后浓缩目的蛋白。2免疫佐剂的准备CpG-ODN 1826序列为5′TCCATGACGTTC CTGACG TT3′非甲基化,全硫代修饰,PAGE纯化。- 20℃保存备用。PBS溶解并与质粒pVAX1-CpG-Loop混匀后备用。DDA溶于pH7.4的10mM Tris-Cl,终浓度为1.25 mg/ml,加热80℃,20分钟,并反复颠倒混匀,冷却到室温与质粒pVAX1-CpG-Loop混合后备用。Lipofectamine TM 2000 40μl/只与质粒pVAX1-CpG-Loop混合后备用。3小鼠的免疫方案:方案1:6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为6组各5只:①对照组:pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。②CpG-ODN高剂量组: CpG-ODN 50μg/只+质粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。③CpG-ODN低剂量组: CpG-ODN 20μg/只+质粒pVAX1-Cp G-Loop 25μg/只。④LipofectamineTM 2000组: Lipofectamine TM 2000 40ul/只+质粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。⑤DDA高剂量组:DDA 250μg/只+质粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。⑥DDA低剂量组:DDA 25μg/只+质粒pVAX1-CpG-Loop 25μg/只。小鼠左右股四头肌注射重组质粒pVAX1-CpG-Loop并混有相应佐剂,两周免疫一次,共免疫三次,末次免疫两周后,无菌取脾,进行T淋巴细胞特异性增殖分析,流式细胞术检测IFN-γ,蛋白特异性CTL活性分析。方案2:分组同方案1。小鼠左右股四头肌注射重组质粒pVAX1-CpG-Loop并混有相应佐剂,两周免疫一次,免疫三次后,每组小鼠分别于第十三,十五,十八周用pVAX1-CpG-Loop (25μg/只)加强免疫三次,末次免疫后两周,无菌取脾,进行T淋巴细胞特异性增殖分析,流式细胞术IFN-γ检测,蛋白特异性CTL活性分析检测。免疫后每周尾尖采血,分离血清,ELISA测定血清抗体效价。方案3:6-8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为5组每组各5只:①对照组:pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。②CpG-ODN高剂量组: CpG-ODN 50μg/只+质粒pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。③CpG-ODN低剂量组:CpG-ODN 20μg/只+质粒pVAX1 -CpG-Loop 100μg/只。④Lipofectamine TM 2000组:Lipofectamine TM 2000 40ul/只+质粒pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。⑤DDA组:DDA 250μg/只+质粒pVAX1-CpG-Loop 100μg/只。小鼠左右股四头肌注射重组质粒pVAX1-CpG-Loop (100μg/只)并混有相应佐剂,两周免疫一次,共免疫三次,末次免疫两周后,无菌取脾,进行T淋巴细胞特异性增殖分析,流式细胞术检测IFN-γ,蛋白特异性CTL活性分析。免疫后每周尾尖采血,分离血清,ELISA测定血清抗体效价。4免疫效果评价4.1 ELISA测定血清抗体效价免疫后每周尾尖采血,分离血清,以犬传染性肝炎病毒抗原每孔100μg/ml包被酶标板,4℃过夜。洗涤封闭后加倍比稀释的小鼠血清100μl,孵育60min后洗涤加HRP标记的二抗孵育60min,OPD显色。酶标仪492nm波长处测吸光度值4.2 T淋巴细胞特异性增殖分析采用MTT方法检测免疫小鼠的T淋巴细胞增殖活性。4.3流式细胞术检测IFN-γ的分泌。加入Loop蛋白30μg/ml和10ng/ml interleukin-2孵育72h。收集细胞,加入荧光标记的抗体CD8-PE,IFN-γ-FITC,固定过夜,用流式细胞仪检测。4.4蛋白特异性CTL活性分析采用LDH释放法。4.4.1效应细胞制备:调整脾淋巴细胞密度至1×107 /ml ,脾淋巴细胞悬液2ml/孔加入6孔板,加入Loop蛋白30μg/ml和10 ng/ml interleukin-2孵育7天,于第7d收集细胞作为效应细胞,进行特异性杀伤活性测定。4.4.2靶细胞的制备:胰酶消化CT26细胞,传代于12孔细胞培养板中,次日进行转染。无血清DMEM稀释的质粒(pVAX1-CpG和pVAX1-CpG-loop)分别与无血清DMEM稀释的Lipofectamine TM 2000混匀并在室温下静置20分钟。每个孔加混合液200μl, CO2培养箱,37℃5﹪CO2培养48小时。4.4.3效应细胞对靶细胞的杀伤活性的检测:上述转染细胞混合作为靶细胞,效应细胞:靶细胞混合比例为100:1, 50:1, 25:1。同时设靶细胞自发释放孔和靶细胞最大释放孔。测492nm波长的吸光值,按下面的公式计算CTL对靶细胞的杀伤活性:实验组释放量-自发释放量最大释放量-自发释放量结果:1碱裂解法大量提取的重组质粒pVAX1-CpG-Loop经双酶切和1.2﹪琼脂糖凝胶电泳鉴定,显示860bp左右的×100%电泳条带。所得重组质粒OD260/OD280在1.8–2.0之间。Western blot结果显示诱导表达蛋白与抗六聚组氨酸抗体特异性结合。诱导表达的Loop蛋白经镍离子亲和层析纯化,纯度可达95%以上。2将重组质粒pVAX1-CpG-Loop与不同免疫佐剂混合后,免疫小鼠,间接ELISA检测显示:各实验组小鼠所产生的抗体效价明显高于pVAX1-CpG-Loop对照组(P<0.05),各组之间无统计学差异(P>0.05)。3 T淋巴细胞特异性增殖分析,方案2和方案3的小鼠检测到T淋巴细胞的增殖活性明显高于同组的pVAX1-CpG-Loop对照组(P<0.05)。方案1的小鼠无明显增殖活性(P>0.05)。pVAX1-CpG-Loop与CpG-ODN(20μg/只)共免疫组的小鼠脾淋巴细胞的增殖活性明显高于其他实验组。4免疫小鼠脾淋巴细胞经流式细胞分析,方案2和方案3的小鼠CD8+T细胞被标记IFN-γ的抗体数量高于同组的pVAX1-CpG-Loop对照组(P<0.05)。方案2免疫的小鼠CD8+T细胞被标记IFN-γ的抗体数量高于方案3免疫的小鼠。方案3的小鼠CD8+T细胞被标记IFN-γ的抗体数量高于方案1免疫小鼠。5蛋白特异性CTL活性分析结果显示,各实验组小鼠LDH释放率高于pVAX1-CpG-Loop对照组(P<0.05)。方案2免疫小鼠LDH释放率高于方案3免疫小鼠。方案3免疫小鼠LDH释放率高于方案1免疫小鼠。方案2免疫小鼠(25μg/只) DDA与pVAX1-CpG-Loop共免疫组小鼠LDH释放率高于(250μg/只)DDA与pVAX1-CpG-Loop共免疫组小鼠。结论:1 ELISA检测:各免疫组小鼠均产生了针对抗原病毒的特异性IgG抗体,且pVAX1-CpG-Loop 100μg/只+ CpG -ODN 20μg/只,pVAX1-CpG-Loop 100μg/只+DDA 250μg/只免疫组的抗体水平明显高于其它实验组。以上结果提示重组质粒pVAX1-CpG-Loop诱导小鼠产生了体液免疫应答,免疫佐剂可有效地增强DNA疫苗诱导的体液免疫应答。2流式细胞分析显示:各实验组小鼠的CD8+T细胞被标记IFN-γ的抗体数量高于pVAX1-CpG-Loop对照组;采用MTT方法检测小鼠脾脏的淋巴细胞增殖活性,实验组小鼠淋巴细胞增殖活性高于pVAX1-CpG-Loop对照组;实验组小鼠LDH释放率高于pVAX1-CpG-Loop对照组(P<0.05)。以上结果提示免疫佐剂能增强重组质粒pVAX1-CpG-Loop诱导小鼠产生特异性的细胞免疫应答。3 DDA,CPG-ODN,Lipofectamine TM 2000三种免疫佐剂均能增强DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop对小鼠的体液免疫和细胞免疫。方案2免疫的小鼠能够产生对Loop蛋白特异性免疫记忆。证明免疫佐剂与低剂量DNA疫苗共免疫结合低剂量DNA疫苗加强免疫的策略是一种非常有效和有潜力的免疫策略。