现代研究　　揭示肺癌是一种生物行为较为复杂的恶性疾病，目前已成为威胁人类健康和生存质量的重大世界性难题。近年来，随着对肺癌发病的病生理机制研究的不断深入，多学科相互交叉以及特异性靶点治疗的广泛应用，肺癌的个体化诊治水平取得了令人瞩目的进步。与此同时，中医药作为一种常规治疗手段在肺癌的治疗中显示出相当的优势和潜力，但对其抗癌机理尚缺乏明确的基础医学阐述和系统的总结，影响了相关中药效能机制的挖掘和临床应用的广泛推广。天花粉是我国传统中草药，天花粉蛋白作为其有效提取物质之一，具有中晚期引产、抗肿瘤、提高机体免疫力、抗人体免疫缺陷等多种药理学特性[1]，目前已成为传统中医药抗肿瘤的潜在性药物。其对正常组织毒副作用较小、抗癌谱广、价格低廉，较传统化疗药物有着显著的优势，因而受到了国内外学者的广泛关注。　　前期试验研究　　已初步证实天花粉蛋白对人肺腺癌A549细胞株具有诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用;天花粉蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的机制主要与阻滞细胞分裂周期以及诱导细胞内JNK信号通路活化有关。细胞骨架—微管结构作为天花粉蛋白在肿瘤细胞内的作用另一个靶点，主要是通过抑制微管的聚合而干扰有丝分裂期纺锤体的形成，导致细胞内骨架结构甚至整个细胞功能结构的改变，同时也使细胞分裂停止于有丝分裂的S期，最终引起了肿瘤细胞的凋亡。可见，TCS诱导凋亡和细胞重构是高度协调一致的。这些研究结果初步证实肺癌A549细胞株是天花粉蛋白的敏感细胞株之一，其可有效地诱导人肺癌A549细胞的凋亡。然而，在诱导细胞凋亡过程中天花粉蛋白特异性的分子生物学和细胞生物学机制仍需要进一步的研究。　　目的:本文旨在通过观察天花粉蛋白诱导人肺癌A549细胞凋亡过程中细胞骨架的改变，及相关JNK信号传导通路或靶点的调节作用，以便从细胞和分子水平上揭示天花粉蛋白诱导A549细胞凋亡的机理，为天花粉蛋白在肿瘤防治中的应用提供重要的实验和理论依据。　　方法:常规培养细胞，MTT法、CCK法测定对细胞增殖的抑制作用，倒置显微镜、Hoechst33342荧光染色和透视电镜下观察凋亡细胞以及超微结构变化。流式细胞术检测细胞凋亡率及各细胞周期的变化、蛋白免疫印迹杂交法（Western-blot法）检测caspase-3、deaved-caspase-3、JNK、p-JNK、c-Jun、细胞骨架蛋白的表达及实时定量PCR验证基因表达。观察天花粉蛋白及在此基础上加入JNK特异性抑制剂SP600125对人肺癌A549细胞株的JNK通路的影响及其细胞骨架微管结构的改变。　　结果:1.天花粉蛋白对肺癌A549细胞凋亡过程中细胞形态结构和细胞周期的研究:MTT法测定A549细胞增殖的抑制，通过不同TCS分别作用于A549细胞24、48、72h，A549细胞抑制率随着药物浓度的增加、作用时间延长而呈上升趋势，且与空白对照组相比，P＜0.05; Hoechst33342结合荧光显微镜下观察细胞形态变化，空白对照组细胞呈圆形，大小较一致，细胞膜完整，呈弥散且均匀分布的淡蓝色弱荧光。TCS作用后，A549细胞呈典型凋亡细胞形态:胞体较前有所减小，细胞核发生固缩，甚至裂成碎片，胞质浓缩，细胞膜结构内形成多个有膜包被的凋亡小体结构，细胞内散在可见深染且密度均一的荧光样颗粒，甚至可存在DNA荧光碎片;透视电镜观察TCS对肺癌A549细胞有明显抑制作用，可见A549肺癌细胞表面微绒毛消失，体积变小，核染色质呈新月形聚集于细胞边缘;流式细胞PI染色（单染）检测人肺癌细胞A549的周期和凋亡，空白组、12.5、25、50μg/ml的TCS作用A549细胞24、48h后的凋亡率((x)±s)分别为0.45±0.21、0.51±0.47、0.74±0.33、2.31±0.53和0.67±0.47、2.38±0.96、2.43±1.12、3.78±1.48。流式结果还显示，不同浓度的天花粉蛋白对细胞周期的影响是G1期时限缩短，而S期期限增加，Sub-G1和G2/M期则变化不大。但是，50μg/ml浓度的天花粉蛋白对细胞周期的作用不明显。2.天花粉蛋白对肺癌A549细胞凋亡信号Caspase-3表达的影响:免疫荧光印迹测定TCS对肺癌细胞A549 Caspase-3表达水平，TCS组药物浓度为25μg/ml始由无活性的pro-caspase-3逐渐被裂解的deaved-caspase-3片段即代表具有活性的caspase-3，并在12.5、25、50μg/ml组活化作用逐渐增强。与此相反，在细胞凋亡的晚期或是已死亡细胞中，caspase-3酶原的活性明显下降，呈低活化或是非活化状态。实时定量PCR检测TCS通过JNK通路对A549肺癌细胞Caspase-3 mRNA表达的研究，TCS处理组随着作用时间延长基因产物表达随之增加，相比于对照组，P＜0.05。预先用JNK特异性抑制剂处理后，且与caspase-3抑制剂z-VAD类似，则蛋白表达量降低;分光光度计测定TCS通过JNK通路对细胞Caspase-3相对活性的改变，自25μg/ml起随着TCS浓度增加，Caspase-3相对活性明显增加(P＜0.05)。其中，100μg/ml的TCS作用A549细胞时酶活性达到最大值，可达对照组的2.43倍。加入SP60012510μM后，caspase-3酶相对活性较前有所下降，且两组差异有统计学意义(P＜0.05)。3.TCS对JNK通路激活的实验研究:CCK法检测TCS通过JNK通路对肺癌细胞A549增殖的影响。与MTT法细胞干预实验结果相似，随着TCS浓度的升高以及处理时间的延长，细胞生长抑制率呈逐渐上升趋势。预先给予JNK特异性抑制剂SP600125作用后，12、24、48h后细胞抑制率((x)±s)分别为1.823±0.057、1.708±0.042、1.597±0.031，高于单纯TCS处理组(1.705±0.049、1.603±0.033、1.542±0.028)，两组差异存在统计学意义(P＜0.05);流式细胞术AnnexinⅤ/PI（双染）检测肺癌细胞A549的周期和凋亡，空白组、12.5μg/ml TCS组、25μg/ml TCS组凋亡率((x)±s)分别为0.9％、28.6％、30.4％，显著高于预先SP处理组的0.5％、8.5％和20.5％，两组数据差异有统计学意义;Western blot蛋白印迹检测TCS对A549细胞凋亡过程中JNK、p-JNK以及下游信号分子c-Jun的表达情况。随着天花粉蛋白浓度的升高，磷酸化JNK(p-JNK)、c-Jun表达水平明显高于对照组(P＜0.05)，而JNK表达水平与天花粉蛋白药物浓度无明显变化(P＞0.05)。其中蛋白表达水平高于对照组(P＜0.05);免疫荧光共聚焦显微镜下，0、12.5、25、50μ g/ml天花粉蛋白作用A549细胞1h后，相比对照组，随着TCS浓度增加c-Jun在核内表达水平明显上升，但12.5μg/ml浓度的TCS组较对照组并没有发生明显的改变。4.天花粉蛋白对肺癌A549细胞亚显微结构及其细胞骨架微管结构的影响:免疫荧光法检测TCS对微管结构的影响。用0和30μg/ml两个不同浓度的天花粉蛋白作用1h，聚焦显微镜下正常细胞胞质中可见清晰的微管蛋白结构，呈细丝状且胞核可见密度均匀的蓝色颗粒;30μg/ml浓度的TCS作用1h后，细胞核呈典型的凋亡形态，同时发现微管蛋白密度减低，部分细丝状的微管结构消失，呈解聚的状态。与之相比，用SP600125预处理后的TCS组并无微管结构的改变。免疫印迹法检测微管蛋白的表达。TCS作用后α-tubulin发生乙酰化，且随着药物剂量的增加其表达水平明显下降，在TCS浓度为50μg/ml时达到最低值;RT-PCR检测骨架蛋白(β-actin、γ-actin)以及微管蛋白亚型基因(α-tubulin、β-tubulin)的表达。对照组细胞内四种mRNAs的拷贝数随着培养时间的延长逐渐升高;然而，TCS处理组细胞内细胞骨架mRNAs的水平较前降低，尤其是actin基因。　　结论:　　(1)天花粉蛋白能够明显抑制肺癌细胞A549的增殖，其机制可能是天花粉蛋白通过诱导细胞凋亡与阻滞细胞分裂周期于S期双重作用机制所致;　　(2)在天花粉蛋白诱导肺癌细胞A549凋亡过程中，可影响相关肿瘤细胞凋亡信号通路的激活，伴有促凋亡基因Caspase-3的表达与活化;　　(3)天花粉蛋白通过激活JNK信号通路来诱导肺癌细胞A549凋亡，并通过JNK、p-JNK以及下游信号分子c-Jun的表达活化，发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡作用;　　(4)天花粉蛋白诱导肺癌细胞A549凋亡的同时，伴随着微管的解聚以及细胞骨架蛋白的改变，其机制可能与JNK通路的激活有关。