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研究背景: 鼻咽癌在中国南方地区有着较高的发病率，严重影响当地人民的生活质量。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗方式。爱必妥(Cetuximab，C225)是针对表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)的一种单克隆抗体，在鼻咽癌病人治疗中，可以作为放疗的增敏剂。 糖基转移酶N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-Ⅴ(GnT-Ⅴ)能催化N-糖链的β1，6分支形成。GnT-Ⅴ及其产物β1，6糖链分支参与了多种肿瘤的侵袭和转移。本课题组前期实验证实:下调GnT-Ⅴ的表达能增加鼻咽癌细胞对放疗的敏感性。另有文献证实:GnT-Ⅴ可通过改变细胞膜表面受体上的β1，6-糖链，影响信号活化传导而导致化疗耐药或放疗抵抗。 由于GnT-Ⅴ及其糖基化产物β1，6-糖链能影响鼻咽癌的放疗敏感性;细胞膜表面受体上N-糖链的改变能影响放疗抵抗;且C225是针对EGFR的单克隆抗体，因此猜想:GnT-Ⅴ可能通过调节EGFR上的糖基化水平，从而影响C225对鼻咽癌细胞的放疗敏感性。 研究目的: 探讨GnT-Ⅴ是否通过调节EGFR的N-糖链β-1，6分支结构影响C225的放疗增敏作用，通过本项目研究，进一步丰富C225放疗增敏作用的分子机制。 研究方法: 1.慢病毒转染鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2，干扰GnT-Ⅴ表达。 2.RNA提取及RT-PCR测mRNA表达。 3.免疫印迹Western blot检测蛋白质表达 4.凝集素实验用PHA-L检测总β1-6糖链表达。 5.细胞功能学实验检测肿瘤细胞恶性行为学。 6.裸鼠皮下成瘤实验及分割放射治疗。 7.免疫组化用PHA-L测裸鼠皮下肿瘤β1-6糖链水平。 8.统计学分析。 研究结果: 1.构建稳定低表达GnT-Ⅴ的鼻咽癌细胞株及检测干扰效果 用慢病毒为载体的shRNA干扰鼻咽癌细胞CNE1，CNE2中GnT-Ⅴ的表达，建立稳定低表达GnT-Ⅴ细胞株。 2.GnT-Ⅴ联合C225对鼻咽癌细胞放疗的影响 (1)测量鼻咽癌细胞中C225的半抑制浓度(IC50) CNE1和CNE2细胞中，测得C225的IC50值分别为:717μg/ml和1244μg/ml。有文献指出:当药物在细胞实验中作为放疗增敏剂时，其实际应用浓度应为IC50值的五分之一[1]。因此在本实验中，C225作为鼻咽癌细胞放疗增敏剂的实验浓度分别为:143μg/ml和249μg/ml。无射线条件下，五分之一的IC50值浓度的C225，对CNE1与CNE2两组细胞的增殖活性无影响。 (2)下调GnT-Ⅴ联合C225能增加鼻咽癌细胞对放疗的敏感性 两株鼻咽癌细胞各分为“放射组”、“下调+放射组”、“C225+放射组”、“下调+C225+放射组”。由克隆形成实验、迁移划痕实验、增殖活性实验及流式细胞实验证实:“放射组”的克隆形成率、细胞存活率和迁移划痕率最高，凋亡率最低;“下调+C225+放射组”克隆形成率、细胞存活率和迁移划痕率最低，凋亡率最高。 3.探讨下调GnT-Ⅴ增加C225的放疗敏感性与EGFR上β1-6糖链的关系。 (1)用苦马豆碱(SW)抑制高表达GnT-Ⅴ的CNE2细胞株上的β1-6糖链，随后将细胞分为“放射组”，“放射+SW组”“放射+SW+C225组”。由克隆形成实验、迁移划痕实验、增殖活性实验证实:克隆形成能力、迁移能力以及细胞活力由高至低分别是:“放射组”，“放射+SW组”“放射+SW+C225组”。因此，β1-6糖链与C225的放疗增敏相关。 (2)CNE1，CNE2两株细胞的各个实验组中，EGFR的mRNA、蛋白水平均无统计学差异。但用凝集素实验检测各实验组中β1-6糖链的水平发现:“放射组”糖链水平最高，“放射+下调+C225组”水平最低。随后用免疫沉淀方法验证EGFR上的β1-6糖链，亦发现:“放射组”中EGFR的β1-6糖链水平最高;“放射+下调+C225组”中EGFR的β1-6糖链水平最低。因此，GnT-Ⅴ影响C225的放射增敏机制可能是由于改变了EGFR上的β1-6糖链。 4.下调GnT-Ⅴ联合C225在放疗条件下对裸鼠成瘤的影响 (1)裸鼠肿瘤生长速度，“放射组”的最快，“下调+C225+放射组”最慢。 (2)免疫组化实验用PHA-L测量裸鼠皮下肿瘤的β1，6糖链表达水平。发现实验组中生长速度快的肿瘤中β1，6糖链的含量更高。 5.GnT-Ⅴ影响C225放疗敏感性的可能信号通路 探究EGFR下游PI3K/AKT通路发现，各实验组磷酸化PI3K和磷酸化AKT的水平不同。实验结果发现，对射线更敏感的细胞，p-PI3K及p-AKT水平更低。 研究结论: 1.靶向GnT-Ⅴ的shRNA真核表达慢病毒可以显著下调GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表达。 2.下调GnT-Ⅴ能进一步增加C225的放疗增敏效果。 3.GnT-Ⅴ影响C225的放疗敏感性可能是通过改变EGFR上的β1-6糖链。 4.下调GnT-Ⅴ联合C225在放疗条件下能减慢裸鼠肿瘤生长。 5.GnT-Ⅴ联合C225影响放疗敏感性可能与PI3K/AKT通路相关。