大豆是重要的经济作物，不仅是人类蛋白和脂类的主要来源，还是生物活性物质异黄酮类化合物的重要来源，同时也是重要的工业原料和家畜饲料。然而，不利的环境因素，如干旱、病害、低温和土壤盐渍化等不良环境因子严重影响大豆的生长发育，给大豆生产造成巨大损失。此外，据报道，大豆异黄酮是一类次级代谢产物,它们是由苯丙烷类代谢途径的一个分支所合成的，这个途径在整个植物界普遍存在。研究发现，大多数MYB转录因子对植物类黄酮的代谢均有调控作用。 MYB是植物中数量最多、功能最多样化的一类转录因子，参与植物次生代谢的调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、细胞周期以及植物叶片等器官的形态建成具有重要的调节作用。同时，MYB转录因子响应生物和非生物胁迫，对植物下游抗逆基因的表达调节起到至关重要的作用。因此，本研究室（李晓微，2012）克隆了GmMYB12B2基因和GmMYB12A基因，并初步证明GmMYB12B2与GmMYB12A均可调控植物的类黄酮的生物合成。对大豆MYB转录因子进行研究，明确其在大豆类黄酮代谢中的地位和作用，阐明其功能，将有助于揭示大豆异黄酮的调控机理。因此，本实验将GmMYB12B2基因和GmMYB12A基对大豆进行遗传转化，并获得高异黄酮转基因大豆品种。虽然转基因大豆已经在全球大规模种植，但目前报道的有关大豆遗传转化方面的研究，转化率还远远没能达到要求。大豆遗传转化方法主要存在以下几大难题：首先，对基因型依赖较大；其次，组织分化再生困难、侵染方法复杂、生长周期长、培养期间添加物繁琐、再生频率高以及再生系统无法与植物转化方法很好的结合。另一方面，中国东北地区冬季寒冷漫长不适合农作物生长，传统育种的周期长是无法克服的缺点，而植物组织和器官培养技术能够在有限的时间和空间快速繁殖，获得大量的植物种质资源，进而满足人们对生产和生活的需要。综合以上因素，有必要对大豆遗传转化体系进行优化。因此，本研究优化了大豆半粒法遗传转化体系,旨在筛选出一个再生频率高、对农杆菌敏感的基因型，并针对其侵染过程中的具体因素进行优化，以建立起一套再生率、转化率都比较高的大豆遗传转化系统。本研究选用5个大豆品种，从再生频率、灭菌时间、农杆菌菌液浓度、激素浓度等方面对大豆半粒法遗传转化体系进行优化。半粒法是大豆子叶节法的一种改进方法，在该方法中，将无菌水浸泡后的大豆种子用镊子和手术刀去掉种皮和部分下胚轴，然后从中间分开两片子叶，去掉胚芽和原叶。在子叶基部，去掉胚芽的地方用手术刀片沿着胚轴方向轻轻的地平行的划3-7刀，深度在1-2mm左右，这样就获得了大豆的外植体。首先是半粒法再生系统的研究。建立起Williams82大豆半粒法子叶节再生体系后，用农杆菌介导法侵染半粒法获得的子叶节，建立起遗传转化体系，并进行具体实施步骤的优化；同时测定不同菌液浓度、不同侵染方法条件下的GUS瞬时表达量进行辅证。研究发现，大豆种子使用氯气灭菌15小时，农杆菌的阈值浓度为OD600={0.7-0.8}，用真空泵侵染15min，可以得到较高的遗传转化率。同时GUS瞬时表达结果证明，在侵染液中添加200μM乙酰丁香酮-AS，遗传转化率最高，达到81.05％；在在侵染液中添加400mg/L的半胱氨酸L-Cysteine，遗传转化率得到显著提高，达到79.05％。此外，T1代组培实验中,大豆生长的各个阶段的激素实验发现各个阶段最适的激素及浓度，如在诱芽阶段，B5添加2mg/L BAP，在芽伸长阶段,MS+5μg/L TRIA+1μM TDZ+0.5mg/LGA3+0.1mg/L IAA，在生根阶段，1/2MS+1.25mg/L IBA或1/2MS+1.1mg/L IAA。最后确定合适的移栽土壤为草炭土：蛭石：大田土=1：1：1。按以上优化后的方法将GmMYB12B2基因和GmMYB12A基因转入Williams82、吉林小粒豆，绥小粒豆1号、恳鉴35和绥小粒豆等5个大豆品种中，使用含有目的基因的根癌农杆菌侵染5种大豆种子，得到了转基因植株。用PCR、bar基因试纸条、Southern Blotting和Western blot检测结果显示，GmMYB12B2基因已转入大豆基因组，并在蛋白水平得到了表达。并将添加筛选剂筛选得到的转化植株进行抗性植株的检测，对T0代进行PCR，Basta叶片涂抹检测及Bar试纸条检测。通过试纸条检测方法检测，T1代植株检测出阳性条带。T2带植株进行Western blot和Southern Blotting检测，同样得到了阳性条带。结果分析表明，5种含GmMYB12A的转基因大豆植物的GmMYB12B2分别在下一代得到表达。本研究对3,746个大豆半粒外植体进行农杆菌侵染转化，得到138株转基因植株，大豆遗传转化系统的转化率从5.81%提高到15.12%(用GmMYB12B2转威廉姆斯82，吉林小粒豆、绥小粒豆1，垦鉴35和绥小粒豆转化率分别为:11.11%,8.15%、15.12%、7.41%and12.37%.用GmMYB12A转威廉姆斯82、吉林小粒豆、绥小粒豆1、垦鉴35和绥小粒豆转化率分别为:9.78%,7.56%,12.89,5.85%and10.22%)。此外，本研究采用高效液相色谱（HPLC）法测定得到转基因植株的异黄酮含量。结果如下：转基因和非转基因的Williams82的总异黄酮含量分别是3.339和2.574μg/mg，威廉姆斯82转基因的总异黄酮量比对照威廉姆斯82高0.765μg/mg；转基因和非转基因的绥小粒豆1的总异黄酮含量分别是3.455和2.349μg/mg。绥小粒豆1异黄酮量的总量比对照绥小粒豆1高1.10μg/mg。结果表明，转基因与该品种非转基因受体异黄酮含量比较提高。