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卤醇脱卤酶能够催化邻卤醇脱卤，将环境中的有机卤化物转化为工业中有价值的环氧化物。并且也可催化其逆反应，亲核试剂介导的环氧化物开环反应。HheC的活性中心由四个柔性Loop区域组成，其中P175-P188的Loop3区域为卤离子结合位点（Loop3）。动力学研究表明卤离子的释放为酶促反应邻卤醇脱卤的决速步骤。在催化环氧化物开环的反应中，HheC能够接受除了卤离子以外的多种亲核试剂，生成的多种手性中间体可以作为制备光学纯化合物的功能模块。此外，最新的研究表明，Loop3中的某些关键氨基酸具有调控HheC对映体选择偏好性的功能。综上所述，卤离子结合位点 Loop3在卤醇脱卤酶催化邻卤醇脱卤及其逆反应中起到极其重要的作用，但是到目前为止，并没有对该区域进行过系统地研究。故本课题开展了相关研究，主要包括以下工作： 应用丙氨酸扫描技术，系统地探究卤离子结合位点关键氨基酸对于酶催化活性和对映体选择性的作用。检测结果显示：1）N176A，S180A，S183A，F186A和Y187A在对脂肪族底物1,3-二氯-2-丙醇保持活性的同时，却对芳香族底物2-氯-1-苯基乙醇的活性严重丧失，该结果表明这些位点可能对两类底物的结合具有不同的影响；2）对于L178，H179，E181，D182，P184位点突变成丙氨酸后酶仍保持对底物的催化活性，表明这些位点对于酶行使其催化功能可能影响不大。同时，H179A针对2-氯-1-苯基乙醇的对映体选择性有一定程度的提高，而L178A却显著下降，表明这两个位点的氨基酸可能对酶的对映体选择性起着关键的作用；3）相对于野生型HheC，Y177A和P188A对两种底物均丧失活性，并且两位点在卤醇脱卤酶中高度保守，表明这两个位点对酶的催化可能起着关键的作用。 为了进一步探究上述关键氨基酸位点在卤醇脱卤酶 HheC行使催化功能过程中所起的主要作用，分别对上述位点进行了单位点的饱和突变研究。通过对所构建的文库进行活性筛选，获得的阳性突变体F12Y，L178V，L178I和F186Y对脂肪族底物1,3-二氯-2-丙醇的催化活性较野生型的活性提高了1.4-3倍。对芳香族底物2-氯-1-苯基乙醇的筛选中并未获得较野生型活性有所提高的阳性突变体，但获得的突变体中较丙氨酸突变体的活性有所提高，表明这些位点对芳香族底物2-氯-1-苯基乙醇的催化活性具有一定的调控作用。通过对N176，L178和H179位点进行饱和突变，N176位点获得了不同类型残基的突变体并进行对映体选择性的测定，结果表明此位点不同性质的氨基酸残基展现出对2-氯-1-苯基乙醇对映体选择性有较大差异；L178位点获得的突变体较野生型对2-氯-1-苯基乙醇的对映体选择性也产生了很大的影响，这些位点可以作为卤醇脱卤酶对映体选择性改造的关键位点。本课题对卤离子结合位点的氨基酸残基的系统研究为后续的卤醇脱卤酶改造奠定了基础。