研究背景：随着人口老龄化问题的日益严峻和居民生活饮食习惯的改变,冠心病(coronary heart disease, CHD)的发病率呈逐年上升趋势,逐步成为人类生命健康的最大威胁,在许多国家和地区,冠心病超越恶性肿瘤成为死亡人数第一位的疾病。我国的冠心病发病率上升速度较发达国家更加迅速,急性心肌梗死发病率较10年前提高了2倍以上,严重影响了人民的生命健康。在急性心肌梗死患者的治疗中,急诊心肌再灌注治疗如急诊静脉溶栓治疗和经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention, PCI)是挽救缺血心肌、改善临床转归的最有效方法。但在临床工作中发现,某些患者经再灌注治疗后,心功能障碍反而更加严重并出现多种恶性心律失常,这种因再灌注导致的心肌细胞结构和功能的损伤我们称之为缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)。缺血再灌注损伤是心肌细胞凋亡坏死、心力衰竭的重要因素,它介导的再灌注心律失常、心肌顿抑和心肌坏死是急性心肌梗死再灌注治疗中的棘手问题,急性心肌梗死动物模型研究提示,再灌注损伤造成的细胞死亡最多可占梗死心肌细胞死亡总量的50%。因此,如何预防和治疗缺血再灌注损伤成为研究的热点。缺血再灌注损伤的主要机制为氧自由基损伤、钙超载、炎症反应等。现阶段研究表明,细胞凋亡是缺血再灌注损伤的重要机制,有学者曾通过抑制细胞凋亡的方法,使缺血再灌注的心肌细胞死亡减少了70%。目前认为,心肌缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡主要是caspases依赖的细胞凋亡途径介导的,它主要由再灌注过程中产生的氧自由基、钙超载、线粒体损伤等,三者单独启动或联合作用通过一定的信号传递方式激活细胞凋亡的关键酶,引发一系列的凋亡酶联反应,最终导致细胞的凋亡。因此通过阻断心肌缺血再灌注损伤中心肌细胞凋亡的信号转导或许能够阻止凋亡的发生,从而减轻心肌缺血再灌注损伤的程度。促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)是在人体肾脏及肝脏分泌的一种耐热酸性糖蛋白激素,它主要作用于红系祖细胞,促进其增生、分化和成熟,对体内红细胞的分化成熟发挥至关重要的作用。以往促红细胞生成素主要应用于肾性贫血的治疗。近来研究发现,促红细胞生成素具有抗氧化、抗凋亡、抗炎、促进上皮细胞增生等作用。EPO主要通过与其细胞表面受体(EPOR)结合而发挥生物学效应,而EPOR广泛存在于心肌细胞、血管内皮细胞、神经细胞、神经胶质细胞、肾上皮细胞等多种细胞类型,大量基础研究表明EPO对心、脑、肺、肝脏等多种器官具有保护作用。在以往的动物实验中,EPO被证实可以减轻急性心肌梗死大鼠模型的心肌梗死面积和透壁程度。Cai等学者在大鼠离体心缺血再灌注实验中发现EPO能够促进心脏收缩功能恢复,减少细胞凋亡；Shingo等学者发现EPO能够促进低氧浓度培养下的神经干细胞产生神经元；Bullar等学者在离体鼠心缺血35min再灌注2h的实验中,发现EPO能够减少心肌缺血再灌注损伤。Omi/HtrA2蛋白是近年发现的一种重要的促凋亡蛋白,它存在于线粒体膜间隙中,当细胞受到损伤时线粒体膜通透性增加,Omi/HtrA2蛋白进入胞质中导致caspases酶联体系激活,引起细胞凋亡。本研究中我们通过建立H9c2细胞缺氧复氧心肌细胞模型来模拟心肌梗死再灌注过程中心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程,EPO于细胞缺氧前预处理模拟临床治疗,观察EPO是否对缺氧复氧心肌细胞具有保护作用,并检测各组细胞caspase-3蛋白及Omi/HtrA2蛋白浓度,探求EPO介导的抗缺氧复氧心肌细胞凋亡的机制,为临床上预防和治疗心肌缺血再灌注损伤、寻找新的方法。目的：本实验拟通过建立体外培养的H9c2心肌细胞缺氧复氧模型,模拟缺血再灌注损伤的病理过程,探讨促红细胞生成素(EPO)对缺氧复氧(H/R)心肌细胞是否具有保护作用,并进一步探讨其机制。方法：1.以乳鼠心肌细胞株(H9c2细胞)为研究对象,将其分为3个组：(1)对照组(control group):对照组细胞行常规培养26h,不做任何处理；(2)缺氧复氧组(H/R group):该组细胞常规培养后将待处理细胞、厌氧袋及氧气指示剂放入厌氧罐缺氧,将厌氧罐置于细胞培养箱,缺氧培养2h,然后重新将细胞放置培养箱复氧24h；(3)EPO干预组(EPO intervention group)：缺氧复氧前24h给予不同浓度的EPO (5IU/ml.,10IU/ml,20IU/ml)行预处理,然后同缺氧复氧组行缺氧2h,复氧24h培养。2.MTS法检测细胞存活率：取指数生长期细胞消化吹散并调整细胞浓度至1×l05个/ml,分别接种到96孔板,待细胞贴壁后,按照实验分组进行处理,处理后的细胞加入cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂,比例为1：10,即100ul培养液加入10ul检测液,孵育4h后,酶标仪检测读取各样本OD490数据,各组数值通过与对照组比较计算细胞存活率。3.细胞上清液LDH浓度检测：11.4ml去离子水溶解一支冻干的底物,充分混合至底物完全溶解。复温分析缓冲液(0.6ml)至室温(避光)。按照0.6ml分析缓冲液：11.4ml底物溶液的比例配制检测液,向96孔板中种植105H9c2细胞,每个测试种三个复孔。37℃5%CO2孵箱孵育过夜。加10ul ddH2O(自发性LDH释放对照)、10ulPBS (溶剂对照及缺氧复氧组)和10ulEPO(5IU/ml,10IU/ml,20IU/ml)至相应的检测孔。按照实验设计分别进行培养。模型结束前45min,向Max孔中加入10ul10×裂解液,轻柔混匀,37℃5%CO2孵箱孵育45min。转移50ul细胞培养上清(培养基对照,自发性LDH对照,最大LDH释放组,实验组)至新的96孔板。各反应孔加入50ul检测液。37℃5%CO2孵箱避光孵育30min。每个反应孔中加入50ul终止液,轻柔混匀。490nm及680nm检测吸光度,LDH活性为(OD490-OD680).计算各组细胞LDH释放率。4.Western Blot检测Cleaved Caspase-3表达：蛋白用Bradford法定量后,采用15%浓度的聚丙烯酰胺凝胶制备凝胶,经SDS-PAGE电泳后将蛋白转至PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭后,将相应的一抗Cleaved Caspase-3(cell signaling#9661,1：1000),4℃过夜后,用TBST每次10分钟洗两次后,用相应的稀释好的二抗(HRP标记二抗,1：5000)室温下孵育1-2h后,用TBST每次10分钟洗三次后,进行化学发光显影(ECL)。用Image J分析目标条带的光密度值。以GAPDH(HC301,1：5000)作为内参照,比较不同处理后上述蛋白表达的差异。5.分离H9c2细胞胞浆及线粒体,Western Blot检测Omi/HtrA2蛋白浓度：实验前需要在Lysis Buffer和Disruption Buffer中加入Protease Inhibitor(100x),所有步骤需要在4℃完成。细胞悬液4℃500g离心10min,小心移除上清；0.9%氯化钠溶液小心清洗细胞；加入1ml(<1×107细胞)冰冷裂解缓冲液(Lysis Buffer)重悬细胞,上下吹打重悬,放入4℃摇床中孵育10min；4℃1000g离心10min,小心的移除上清,上清即为胞浆蛋白；加入1.5ml冰冷的Disruption Buffer重悬细胞,上下吹打重悬。用注射器缓慢的吸起液体再一次性推出,重复10次；4℃1000g离心10min,小心的吸取上清至新的离心管中；再将该上清4℃6000g离心10min,小心的移除上清：lml mitochondria storage buffer清洗线粒体沉淀,上下吹打重悬,4℃6000g离心20min；100ul laemmli buffer溶解线粒体沉淀,后续采用WB进行检测。结果：1.心肌细胞存活率变化H/R组细胞存活率较对照组细胞存活率明显下降(P<0.05),而EPO干预组较H/R组细胞存活率高(P<0.05),各EPO处理组细胞细胞存活率亦不同,其中以5IU/ml EPO处理组细胞存活率较低,20IU/ml EPO处理组细胞存活率最高,但均未恢复到对照组水平；这说明缺氧复氧可诱导心肌细胞的凋亡及坏死,而EPO可以抑制缺氧复氧对细胞的损伤作用,对心肌细胞的缺氧复氧损害有保护作用。2.细胞上清液LDH浓度H/R组细胞上清液LDH释放率较对照组明显上升,EPO处理组细胞上清液LDH释放率较H/R组下降,且下降程度与EPO浓度呈正相关,各组间差异均有统计学意义。3.细胞Cleaved Caspase-3表达检测H/R组细胞表达Cleaved Caspase-3较对照组升高(P<0.05), EPO处理组Cleaved Caspase-3表达较H/R组下降,各组间差异均有统计学意义。这表明EPO处理组的caspases途径激活减弱,凋亡过程受到了抑制。4.细胞质Omi/HtrA2蛋白浓度对照组细胞胞浆(Cyto)中未检测到Omi/HtrA2蛋白,H/R组细胞胞浆中Omi/HtrA2蛋白表达明显增高,线粒体(Mito)中表达明显减少；这说明在细胞正常生理状态下,Omi/HtrA2蛋白存在于细胞线粒体中,胞浆中不含或仅含有极其微量的Omi/HtrA2蛋白,细胞受损后,大量的Omi/HtrA2蛋白从线粒体转位至胞浆中,诱导细胞凋亡的发生。与H/R组细胞相比,EPO处理组胞浆中Omi/HtrA2蛋白表达较低,线粒体中表达较多；这说明EPO抑制了Omi/HtrA2蛋白的转位过程。结论：缺氧复氧可诱发心肌细胞凋亡,EPO可减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制Omi/HtrA2蛋白表达及转位,从而抑制了Caspases通路的激活有关。