外源性双链RNA(dsRNA)能高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱发出特定基因沉默，此种现象被称为RNA干扰(RNAinterference，RNAi)。RNAi现象广泛存在于自然界中。 小分子干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)在RNAi中起着核心作用：长链dsRNA进入细胞被Dicer酶切割成大小为21～23个核苷酸的siRNA；然后siRNA结合一个酶复合物，形成RNA诱导沉默复合物(RISC)；接着双链siRNA被RISC解旋，识别并结合与之互补的靶mRNA，启动RISC降解靶mRNA。其特异的抑制基因表达属于转录后沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)，具有特异性、高效性，可以在细胞间传递，因此已经成为研究的热点。 RNAi现象在生物中存在的普遍性以及RNAi作用机制和生物学功能的初步阐明，为RNAi的应用提供了理论基础。在基因功能研究方面，人们采用RNAi可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失，作为一种强有力的研究工具研究基因功能，尤其对那些不能实施基因操作的生物体尤为有效。有研究表明，siRNA能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，产生类似基因敲除的效应。基因治疗方面，它被用于病毒性疾病的治疗，RNAi技术已经被尝试用于阻止艾滋病病毒进入人体细胞、乙型肝炎病毒的复制等；在肿瘤治疗方面，siRNA抑制癌基因及血管内皮生长因子表达而抑制肿瘤生长已有报道。 幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori，Hp)是一种全球性流行的病原菌，在人群中检出率为30％～80％，是慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌的重要致病因子，WHO已明确指出Hp为Ⅰ类致癌原。鞭毛是Hp定植及感染持续存在的重要条件之一，编码鞭毛蛋白的基因被称flaA和flaB，flaA基因已被克隆测序，它编码主要的鞭毛蛋白，决定着Hp鞭毛的功能。cagA基因是Hp的重要毒力基因，以它作为Hp的毒力标志，可将Hp分为cagA+菌株和cagA-菌株两大类，研究显示cagA+菌株感染者胃粘膜炎症、损伤程度较cagA-菌株重，提示cagA基因可能与Hp感染相关炎症发生有关，具体机制尚不明确；cagA+菌株感染者胃癌发生的危险较cagA-菌株高数倍，表明cagA基因与Hp感染相关胃癌关系密切，因此深入地了解cagA的功能具有十分重要的意义。 由于Hp是革兰氏阴性杆菌，生长较缓慢，对外界环境敏感，培养易遭污染，不易人工转化，国内外有关其转化的方法及报道不多，电转化的报道更少，本实验拟以RNAi为工具研究Hp基因并试图干扰其基因表达，因而对其转化条件进行优化是十分必要的。 本实验分为以下三部分： 第一部分.siRNA抑制HpflaA基因表达 目的:优化Hp的电转化条件；利用siRNA特异性抑制flaA基因表达。方法:设计荧光标记的非特异性siRNA，组合不同的电场强度和脉冲时间、细菌浓度与siRNA浓度；找到电转化Hp的最佳条件，观察转化效率和Hp存活率；然后设计针对基因序列已明确的flaA基因(NO.AY319298)的特异性siRNA分子S1-S5及非特异性siRNA分子-S6，在最佳电转化条件下将siRNA转化Hp，RT-PCR方法检测flaAmRNA的抑制率。实验分组：flaA-S1，flaA-S2，flaA-S3，flaA-S4，flaA-S5，对照组：flaA-S6。结果:电场强度和脉冲时间是影响转化效率的两个关键因素，最佳转化条件为25kV/cm电场强度下脉冲6ms,当细菌浓度为108CFU/ml,siRNA为100μg/ml时电转化率最高达95％，高于其它组(P＜0.05)。在最佳转化条件，Hp存活率与转化前无显著性差异(P＞0.05)。flaA-s2、flaA-s3组在转化后flaAmRNA抑制率随siRNA浓度增大而增加，在100μg/ml分别为72.1％和53.8％高于10μg/ml、1.0μg/ml组(P＜0.05)。结论:适当的场强和脉冲时间的组合可使转化率达到最大值。特异性siRNA可以抑制HpflaA表达。 第二部分.siRNA抑制HpcagA基因表达及对GES-1分泌IL-8的影响 目的:利用siRNA干扰cagA表达及观察对人胃粘膜上皮细胞株GES-1分泌IL-8的影响。方法:设计5条针对cagA(No.AB015416)的特异性siRNA分子-Si、S2、S3、S4、S5及一条非特异性的S6，采用最佳电转化条件：25kV/cm，脉冲6ms,细菌浓度为108CFU/ml,siRNA为100μg/ml转化CagA+HpNCTC11637，然后与GES-1共培养(比例为100∶1)，测定共培养前、共培养后6h、12h、24h、48hIL-8水平，并以RT-PCR、Westernblot法检测穿孔前、后不同时点细菌的cagAmRNA、CagA蛋白表达，并对RT-PCR产物克隆测序，采用cagA-株G50作对照。结果:RT-PCR产物克隆测序证实所扩增片段为cagA,RT-PCR结果表明siRNA-S3转化的幽门螺杆菌cagAmRNA水平显著低于转化前，穿孔后6hmRNA水平最低为31.3％(0.27/0.861)，抑制率为68.7％。Westernblot检测到S3组CagA蛋白带在电穿孔后6h低于穿孔前，半定量分析显示为电穿孔前的61.5％(0.8/1.3)，12h最弱为30.7％(0.4/1.3),24h为46.1％(0.6/1.3)(P＜0.01)，48h后基本正常。cagA+株NCTC11637诱导胃粘膜上皮细胞分泌IL-8水平明显高于cagA-株G50(1200.0±32.5pg/mlvs100.0±8.5pg/ml)(P＜0.01)。S3组转化的Hp诱导GES-1细胞分泌IL-8水平显著低于转化前(400.0±17.0pg/mlvs1200.0±32.5pg/ml)，(P＜0.05)。结论:siRNA特异性抑制cagA表达,cagA的表达在Hp诱导GES-1分泌IL-8中起重要作用，特异性SiRNA下调Hp诱导的GES-1分泌IL-8水平。 第三部分.cagA+Hp菌株培养滤液对GES-1生长的作用及siRNA影响 目的:研究cagA+Hp菌株培养滤液对GES-1生长的作用及siRNA的影响。方法:分为三组：cagA+组,cagA+的Hp菌株NCTC11637不加siRNA处理直接制备培养滤液；cagA-组,cagA-Hp菌株G50不加siRNA处理直接制备培养滤液；siRNA-S3转化组，将100ug/ml特异性siRNA-S3采用前述电转化条件转入cagA+的Hp菌株NCTC11637，培养12h后取样本制备培养滤液。培养滤液的制备：取浓度为108CFU/ml的Hp10ml，3000×g离心5min，取上清液经Milipore超滤离心管浓缩40倍，并用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。分别以上述不同的培养滤液处理GES-1细胞，并置37℃,CO2孵箱中1h后，加入完全培养基培养。3～5d换液1次，每次换液或传代后均加入Hp培养滤液100μl/皿,连续培养1个月。采用光镜、电镜观察GES-1细胞的形态变化、采用细胞生长曲线、克隆形成实验、流式细胞仪等观察GES-1细胞生长、并用单细胞微凝胶电泳检测GES-1细胞DNA的损伤，观察不同的培养滤液对GES-1的作用。Westernblot法检测不同培养滤液中CagA蛋白表达。结果:经cagA+组处理的GES-1细胞，细胞核增大、畸形、核染色质变粗、核仁肥大、核分裂。生长曲线可见细胞增生活跃，克隆形成试验显示细胞克隆形成能力增强，克隆形成率达到40.0％。流式细胞仪S期细胞比率显著高于cagA-组(43.50％vs10.83％,P＜0.05)。cagA+培养滤液可使41.2％的GES-1细胞出现彗星现象。siRNA-S3转化组S期细胞比率为25.76％、彗星细胞率为17.5％，克隆形成率为19.4％，显著低于cagA+组(p＜0.05)。Westernblot见siRNA-S3转化组CagA蛋白条带明显弱于cagA+组，cagA-组组则无CagA蛋白条带。结论:CagA在Hp培养滤液促使GES-1细胞呈肿瘤细胞的形态学改变及生长特征中起重要作用。DNA损伤可能是CagA诱导GES-1生长特征改变的机制之一；siRNA特异性抑制cagA表达而减轻这一改变。