牙周炎是普遍发生在牙周组织的慢性免疫炎症性疾病,会导致牙龈组织、牙周韧带的慢性炎症和邻近起支持作用的牙槽骨的渐进性吸收,并最终造成牙齿松动脱落。已被医学界定论为继恶性肿瘤、心脑血管疾病之后,威胁人类身体健康的第三大疾病（Cao,2003）。目前认为,牙周炎由牙菌斑内的数种特定细菌引起,机体对这些细菌的免疫反应则会促使炎症进一步发展。牙龈卟啉单胞菌是一种革兰氏阴性专性厌氧杆菌,是导致慢性牙周炎发生和发展的重要致病菌之一,也是牙周炎病变区或活动部位最主要的优势菌（Holt et al.,1999;Rautemaa et al.,2004）。来源于宿主细胞的细胞因子是机体对牙龈卟啉单胞菌感染所作出的免疫应答,而这些细胞因子不仅在宿主的免疫防御中起作用,也在牙周炎症所导致的牙周组织崩解中起着重要的作用。活化的淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞渗入到发炎的牙龈组织中,同时分泌促炎细胞因子,包括IL-6、IL-1、TNF-a和前列腺素E2等。这些细胞因子可以诱导牙周疾病中牙槽骨的吸收（Eastcott et al.,1994;McKenna and O’Malley,2002;Froicu et al.,2003）。最终出现牙周炎的典型临床症状:牙周组织的慢性炎症和牙槽骨的吸收,这也是导致成年人牙齿缺失的主要原因。随着研究的不断深入,越来越多的研究发现维生素D具有调节免疫系统,维持免疫系统平衡的重要作用。相关研究证明维生素D除了可以影响钙和磷酸盐的内环境稳态,协助避免儿童佝偻病和骨质疏松症之外,还具有影响天然和适应性免疫系统的作用（Adams et al.,2007;Bikle,2008）。l,25（OH）2D3是维生素D在体内的最终生物活性成分,其与维生素D受体结合,作用于靶组织,从而发挥其生物学效应。本课题通过采用牙龈卟啉单胞菌诱导的小鼠颅骨感染模型模拟牙周炎来观察1,25（OH）2D3是否能减轻组织的破坏,并且从抗炎和骨保护两方面探讨1,25（OH）2D3作为牙周炎辅助治疗药物的作用机制。本课题分为以下三个部分进行:第一部分:1,25（OH）2D3对小鼠颅骨感染模型的疗效实验目的:建立牙龈卟啉单胞菌感染的动物模型,观察1,25（OH）2D3对牙龈卟啉单胞菌诱导的组织破坏是否能起到保护作用。实验材料和方法:将32只雄性Balb/c小鼠随机分为4组,每组8只:溶剂+PBS 组、溶剂+Pg组、1,25（OH）2D3+PBS 组、1,25（OH）2D3+Pg 组。灌胃法给予1,25（OH）2D3,每天一次。将一定浓度的牙龈卟啉单胞菌菌液注射于小鼠颅骨中线两耳之间的部位建立小鼠颅骨感染模型,在建模第六天处死小鼠。取颅骨表面软组织拍照,完整颅骨进行micro-CT扫描,观察颅骨的骨质破坏情况。颅骨脱钙制成切片,应用HE染色观察炎症细胞浸润情况。TRAP染色法检测颅骨中破骨细胞的含量。实验结果:Micro-CT结果显示1,25（OH）2D3减少了颅骨的骨吸收程度,1,25（OH）2D3+Pg组的骨缺失面积、矢状缝面积及骨小梁分离度比溶剂+Pg组明显降低;1,25（OH）2D3+Pg组的骨体积分数、骨小梁数目显著高于溶剂+Pg组。溶剂+Pg组与颅骨接触的软组织表面可见明显的水肿及脓肿存在,1,25（OH）2D3+Pg组软组织的炎症反应明显减轻,与溶剂+PBS组及1,25（OH）2D3+PBS组没有明显差异。HE染色结果表明1,25（OH）2D3+Pg组的炎症细胞浸润和骨质破坏情况明显减轻。TRAP染色结果亦观察到1,25（OH）2D3+Pg组的阳性破骨细胞数目比溶剂+Pg组明显减少。结论:1,25（OH）2D3能够减轻牙龈卟啉单胞菌诱导的小鼠颅骨的骨质吸收破坏、炎症浸润。第二部分:1,25（OH）2D3的骨保护作用实验目的:RANKL、OPG、c-Fos、NFATc1、CTSK、TRAP 是调节破骨细胞分化及其进行骨破坏的关键分子。通过动物实验检测1,25（OH）2D3对这些分子的作用,探讨其在骨保护方面的可能机制。实验材料和方法:采用小鼠颅骨感染模型,提取颅骨中的RNA,应用real-time PCR 检测颅骨中 RANKL、OPG、c-Fos、NFATc1、CTSK、TRAPmRNA 的表达情况。提取颅骨蛋白,用Western blot检测CTSK的蛋白表达情况。颅骨脱钙制成切片,应用免疫组化染色检测CTSK的变化。实验结果:Real-time PCR结果显示1,25（OH）2D3对牙龈卟啉单胞菌引起的RANKL表达增多有显著的抑制作用,1,25（OH）2D3+Pg组的c-Fos、NFATc1、CTSK、TRAP mRNA表达水平明显低于溶剂+Pg组。Western blot及免疫组化检测的CTSK表达情况与real-time PCR结果一致,1,25（OH）2D3能明显降低CTSK的表达。结论:1,25（OH）2D3能调节破骨细胞分化及活性的关键分子RANKL、c-Fos、NFATc1、CTSK、TRAP的表达,从而对骨组织起到保护作用。第三部分:1,25（OH）2D3的抗炎作用实验目的:促炎细胞因子IL-6和抗炎细胞因子IL-10在炎症过程中发挥重要的作用,并由MAPK及NF-κB信号通路调控。本实验从体内和体外两个方面检测1,25（OH）2D3对细胞因子的影响,评估1,25（OH）2D3是否具有抗炎作用。实验材料和方法:在细胞实验中,对牙龈卟啉单胞菌刺激的小鼠巨噬细胞RAW264.7加入1,25（OH）2D3处理,应用real-time PCR及ELISA检测细胞因子mRNA及蛋白的表达变化情况。Western blot检测MAPK及NF-κB信号通路的变化情况。并使用MAPK及NF-κB信号通路的特异性抑制剂分别抑制相关的信号通路,real-time PCR及ELISA检测其对细胞因子的影响。在动物实验中,提取皮肤组织中的RNA,应用real-time PCR检测皮肤组织中IL-6、IL-10、IL-1β、IL-12p40和TNF-α mRNA的表达情况。提取皮肤蛋白,用Western blot检测IL-6、IL-10的蛋白表达情况。ELISA检测血清中的IL-6、IL-10的表达情况。实验结果:在细胞实验中,1,25（OH）2D3能抑制牙龈卟啉单胞菌刺激的RAW264.7细胞中炎症细胞因子IL-6的表达,并上调抗炎细胞因子IL-10的表达。1,25（OH）2D3能抑制细胞中p38,ERK1/2的磷酸化及NF-κB的活化。在动物实验中,1,25（OH）2D3能显著抑制皮肤组织及血清中IL-6的表达并升高IL-10的表达。结论:1,25（OH）2D3可以通过阻断p38,ERK1/2及NF-κB信号通路来调节细胞因子的表达,从而发挥较好的抗炎作用。综上所述,通过牙龈卟啉单胞菌诱导的小鼠颅骨感染模型证实了1,25（OH）2D3可以有效抑制牙龈卟啉单胞菌引起的骨质吸收和软组织破坏,其作用机理来源于1,25（OH）2D3的骨保护和抗炎作用。1,25（OH）2D3能降低RANKL及破骨细胞相关基因的表达,能通过阻断MAPK及NF-κB信号通路调节细胞因子的表达。