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目的：1.构建CPPs—BDI-1—载MMC白蛋白纳米微球三联体进行体内外膀胱癌细胞的杀伤研究，为探索治疗膀胱癌的方法提供实验基础。2.观察三联体介导的对EJ人膀胱癌细胞生长的抑制作用，探索载MMC白蛋白纳米微球抑制膀胱肿瘤生长的机理。3.建立裸小鼠皮下瘤和原位膀胱癌模型，观察单纯三联体瘤内注射及膀胱灌注给药，以及同时联合紫杉醇白蛋白纳米微球经腹主动脉注射给药的治疗作用。方法：1. MMC-NS的制备及质量鉴定：通过交联固化的方法制备丝裂霉素白蛋白纳米微球（MMC-NS），正交实验优化MMC-NS的制备工艺，分别选择油相/水相比、高速分散速度、白蛋白浓度、搅拌固化时间4个影响因素，以微球粒径小于300nm的粒子分布百分数、微球的载药量（DL）、药物包封率（DTE）3个指标作为优化技术的评估指标。扫描电镜观察微球的形状和分布；体外释药方法及释药特性的研究。2. TAT-EGFP融合蛋白的制备及鉴定：(1).含TAT11寡核苷酸双链pT7460载体的构建；(2). pT7460-EGFP载体的构建；(3). TAT-EGFP融合蛋白的表达和纯化。3.抗体BDI-1-CPPs偶联物的制备：(1). BDI-1单克隆抗体的制备与纯化：(2).BDI-1与TAT-EGFP融合蛋白的连接。4. CPPs—BDI-1—载MMC白蛋白纳米微球三联体的制备及鉴定。5. CPPs—BDI-1—载MMC白蛋白纳米微球三联体对人膀胱肿瘤细胞体外杀伤作用的机制研究。6. CPPs—BDI-1—载MMC白蛋白纳米微球三联体对种植裸小鼠体内的原位膀胱癌和皮下瘤的抗肿瘤治疗效果研究。结果：1.成功制备了三联体的原料：⑴.研制成功载丝裂霉素白蛋白纳米微球，粒径（314.18±31.093nm），载药量为1.24%，包封率为63.24%，大小均匀，表面光滑，分散性好，可用于后续实验；⑵.应用大肠杆菌成功制备并鉴定具有高活性的融合蛋白穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白（TAT-EGFP）；⑶.摸索了腹水法制备高效价BDI-1抗体的条件，并鉴定BDI-1人膀胱癌单克隆抗体浓度1.5mg/ml、效价为20000，实验证明具有高抗体活性。2.通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜监测证实：成功连接具有高度特异性、穿膜活性的CPPs—BDI-1—载MMC白蛋白纳米微球三联体。3.体外实验证明了CPPs—BDI-1—MMC-NS三联体对EJ人膀胱癌细胞具有高效的杀伤效果；应用荧光探剂Fura-2/AM，通过RF-5301PC荧光分光光度计，检测用药后细胞内钙离子浓度的最大吸收峰值，证实CPPs—BDI-1—MMC-NS三联体增加细胞内钙离子浓度呈时间相关性。其抗肿瘤作用机制之一，可能是通过内化入肿瘤细胞内部激发胞内游离钙离子浓度的升高，诱导肿瘤细胞凋亡；通过荧光定量RT-PCR检测，白蛋白可引起白蛋白受体SPARC蛋白基因过表达，CPPs–BDI-1-MMC-NS可进一步增强SPARC蛋白基因过表达。4.首次发现肿瘤细胞膜表面微绒毛与细胞穿膜肽内化载药白蛋白纳米微球入细胞内部相关，且微球内化入肿瘤细胞后微绒毛消失。5.创立一项国家发明专利（发明创造名称：裸小鼠膀胱癌原位模型建立方法和装置；发明专利号：201110325574.2）。使用本专利发明的手术器械将EJ人膀胱癌细胞种植在裸小鼠膀胱上，可更高效更科学地建立原位膀胱癌模型。6.成功将髂内动脉灌注紫杉醇白蛋白纳米药物治疗方案应用于裸小鼠，并联合膀胱灌注CPPs–BDI-1-MMC-NS三联偶联物进行体内实验，取得良好的治疗效果。总结了腹部反复切开给药的方法，为需要反复开腹给药的实验提供了一手实验资料。结论：1.自行研制的CPPs—BDI-1—载MMC白蛋白纳米微球三联体，具有高度的穿膜活性和特异性，可用于后续完成实验。2.体外实验证明了CPPs—BDI-1—MMC-NS三联体有促进体外培养的EJ人膀胱癌细胞凋亡，具有高效的杀伤效果。基本机制可能是：⑴. CPPs—BDI-1—MMC-NS三联体增加细胞内钙离子浓度呈时间相关性，其抗癌作用机制之一，可能是通过内化入肿瘤细胞内部，激发胞内游离钙离子浓度的升高，以诱导肿瘤细胞凋亡；⑵.白蛋白可引起SPARC基因过表达，CPPs–BDI-1-MMC-NS可进一步增强白蛋白受体SPARC基因过表达，可促进肿瘤产生更多的SPARC蛋白与载药白蛋白微球结合，可能是载药白蛋白纳米微球高效杀伤肿瘤细胞的机制之一。3.细胞穿膜肽内化载药白蛋白纳米微球入细胞内，可能与细胞膜表面微绒毛的协助相关。4.自行研制的建立裸小鼠膀胱癌原位模型的国家发明专利，可将人膀胱癌细胞种植在裸小鼠膀胱上，建立更科学的原位膀胱癌模型。5.对裸小鼠原位膀胱癌灌注CPPs—BDI-1—MMC-NS三联体联合髂内动脉灌注紫杉醇白蛋白载药纳米微球的治疗方案，较单纯膀胱灌注三联体取得更好的治疗效果；CPPs-BDI-1-MMC-NS组的膀胱相对重量（5.18±4.26）明显小于MMC组（7.12±0.27）（P<0.01）；CPPs-BDI-1-MMC-NS组、MMC组的抑瘤率分别为61.74%、20.99%。三联体用药安全无明显骨髓抑制及肝肾功能损害。