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研究目的:拟根据HBV(Hepatitis B virus,HBV)感染细胞的关键事件,探讨家蝇抗菌肽Cecropin(Musca domestica cecropin,MDC)抗HBV感染作用机制;外泌体作为细胞间交流的新方式,可携带病毒感染相关生物学信息,对病毒感染最终的结局有着重要的影响,本实验旨在探索HepG2.2.15细胞上清来源的外泌体是否介导HBV感染,MDC是否干预外泌体介导的HBV感染过程。研究方法:1.家蝇抗菌肽Cecropin抗HBV作用机制研究:(1)Hi-Trap肝素亲和层析柱法纯化HBV颗粒;电镜负染观察HBV形态。(2)MTT实验检测药物对HepaRG细胞增殖影响;12天感染实验中利用Real-time PCR实验检测MDC对HBV黏附/进入及进入后阶段的影响;激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测HBV黏附细胞阶段加入药物对感染率的影响;MTT实验检测药物对HepG2.2.15细胞毒性作用,Real-time PCR、ELISA、激光共聚焦显微镜及Western blotting检测MDC对HepG2.2.15细胞内HBV复制的影响。(3)激光共聚焦显微镜观察MDC在细胞内分布及定位;Real-time PCR、Western blotting检测MDC对JAK/STAT信号通路的影响。2、家蝇抗菌肽Cecropin抑制外泌体介导的HBV感染作用研究:(1)试剂盒提取HepG2.2.15细胞上清中外泌体(HepG2.2.15-EXO);电镜负染检测外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径,Western blotting检测外泌体标志性蛋白,PCR技术检测外泌体是否含HBV核酸成分;超高分辨率活细胞3D显微成像仪观察外泌体在细胞内的定位;(2)流式细胞术检测外泌体在细胞中的扩散与传递,ELISA,Real-time PCR,ICC,Western blotting检测HepG2.2.15-EXO是否介导HBV的感染,及探讨MDC是否干预外泌体介导的HBV感染;(3)流式细胞术检测外泌体浓度、共同孵育时间温度、肝素及肝素酶对外泌体在细胞间扩散传递的影响;Real-time PCR检测肝素及肝素酶对细胞内HBV-DNA的表达影响;研究结果:1、家蝇抗菌肽Cecropin抗HBV作用机制研究:(1)电镜观察显示MDC作用后HBV颗粒结构破坏,并发生凝集反应;(2)在HBV攻击细胞前或后加入药物干预,结果显示MDC能使细胞HBV相关指标(细胞内HBV-DNA,HBVcccDNA,pgRNA含量)降低,在HBV的黏附/进入及进入后阶段均发挥了抑制作用;MDC可显著降低HepG2.2.15细胞上清中HBsAg、HBeAg抗原及HBV DNA含量,细胞内HBsAg、HBcAg蛋白含量,具有抑制HBV复制作用。(3)激光共聚焦显微镜观察显示MDC作用位点主要在细胞膜,细胞质及细胞核也有结合;且MDC能激活JAK/STAT抗病毒信号通路,发挥抗病毒作用。2、家蝇抗菌肽Cecropin抑制外泌体介导的HBV感染作用研究:(1)对试剂盒法提取的外泌体,进行电镜形态学检测,纳米颗粒跟踪技术的粒径检测,及外泌体标志性蛋白检测,确定提取的为外泌体,可以进行后续实验;PCR技术核酸检测显示外泌体中存在HBV核酸;(2)流式细胞术、ELISA、ICC、Western blotting及Real-time PCR实验结果显示经外泌体共同孵育的正常肝细胞HBV呈阳性表达,而家蝇抗菌肽Cecropin作用后,上述细胞内HBV相关指标的表达显著降低;(3)外泌体浓度、共同孵育时间、共同孵育温度、肝素、肝素酶对外泌体在细胞间扩散传递有一定影响。结论:家蝇抗菌肽Cecropin可破坏HBV病毒颗粒结构,并使其发生凝聚;此外其对HBV病毒生命周期中的黏附/进入阶段及进入后的复制阶段均有抑制作用;MDC可通过激活抗病毒信号通路,发挥其抗病毒作用;提示MDC抗HBV作用机制复杂,涉及多个靶点;此外HepG2.2.15细胞上清来源的外泌体可介导HBV感染,而MDC对外泌体介导的HBV感染具有显著抑制作用。